一种用于miRNA检测的装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种miRNA检测的装置，将激光诱导荧光检测法(LIF)检测技术与芯片结合对miRNA进行检测。利用芯片进行DSN酶切放大反应对miRNA进行信号放大，激光诱导荧光检测器接收并分析信号，将灵敏度提高约5个数量级，且酶切反应耗时短，特异性高，所需样本量少；开发的芯片能够DSN酶、分子信标的储存固定，确保酶切放大反应顺利进行，制作简单，能够满足多种通量要求，适用于不同体积样本的检测。本发明专利技术不涉及复杂的程序或复杂的仪器，成本低，操作简单，方便快速。

A device for miRNA detection

【技术实现步骤摘要】
一种用于miRNA检测的装置
本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种用于miRNA检测的装置。
技术介绍
核苷酸小分子RNA（miRNA）是一类非蛋白质编码，只有19-24个核苷酸的内源性短RNA。miRNA不编码蛋白质，但可在转录后调控基因表达，影响蛋白质的翻译，在人体细胞发育、分化、增殖、凋亡和免疫系统的各种生理过程中起重要作用。同时miRNA也被证实与多种疾病，特别是人的癌症密切相关，例如miRNA-31，最早在A549细胞中发现，研究表明miRNA-31是癌细胞增殖、侵袭及迁移过程中重要的调控因子，在结直肠癌、头颈癌瘤、肝癌、肺癌等多种癌细胞系过表达，显示出显著的临床相关性。因此，miRNA逐渐成为癌症早期监测的新型生物标志物。miRNA具有调节人体发育和生理过程的重要生物学功能，因此，已开发出各种技术用于miRNA的定量分析，最常见的miRNA检测方法有：Northern印迹分析、微阵列芯片技术、反转录-聚合酶链反应（PT-PCR）和荧光成像技术。传统的Northern印迹分析技术灵敏度较低，相对耗时且需要大量RNA样品；微阵列芯片技术具有高通量但需要极其精确的仪器，并且还存在不期望的交叉杂交和低灵敏度的问题；qPCR灵敏度高，但成本高，过程复杂且需要特殊的实验室技能。此外，miRNA易降解，在细胞表达水平低，序列同源性高，这极大地限制了miRNA的检测。因此，开发出一种简单、快速的miRNA检测技术具有重大意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种用于miRNA检测的装置，结构简单，成本低，操作便利；使用本专利技术装置进行mi-RNA检测，特异性好，灵敏度高，耗时短，适用性强。为达到上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：－芯片，为miRNA信号放大反应的载体，设有若干反应单元；－透明夹片组，包括上夹片和下夹片，上夹片和下夹片叠合形成的一中间夹层，供所述芯片容置；－固定件，使上夹片、芯片和下夹片紧密贴合，彼此之间不发生相对位移；－活动部，设于透明夹片组下方，用于为反应单元提供可移动的检测接口；－检测器，设于活动部下方，用于接收和分析所述芯片反应单元的miRNA信号；－驱动件，与活动部连接并驱动其移动；所述活动部设有通孔，作为芯片-检测器检测接口，使驱动件带动活动部移动时，检测器的激发光能透过所述通孔照射到芯片反应单元，使反应单元miRNA信号得到激发而产生荧光，被检测器接收，通孔的大小至少能使激发光透过后在芯片的照射面积覆盖一个反应单元，通过活动部的移动，完成不同反应单元与检测器的对接。优选的，所述芯片包括纸质基底和固态蜡薄层；通过将设计图案打印到所述纸质基底，加热使纸质基底上的固态蜡薄层融化并渗透到纸质基底中，形成对应设计图案的疏水化反应孔；所述设计图案为对称图案，使得芯片对折后上、下层反应孔重合，每一对重合反应孔为一反应单元。进一步的，利用所述反应单元进行miRNA信号放大反应并检测的方法如下：S1：将分子信标溶液/DSN酶溶液加入上层反应孔/下层反应孔，或分子信标溶液/DSN酶溶液加入下层反应孔/上层反应孔，对折芯片，使分子信标和DSN酶固定在所述反应单元；S2：将待测液加至反应单元，使其由上层反应孔渗透至下层反应孔；S3：目标miRNA与分子信标碱基互补配对，形成双链结构，DSN酶剪切DNA-RNA双链中的DNA，释放目标miRNA，目标miRNA继续结合新的分子信标，DSN酶继续剪切，直至分子信标或DSN酶消耗完全；S4：在DSN酶剪切过程中，分子信标带有的荧光基团和猝灭基团相互远离而使荧光恢复，DSN酶的反复作用使得荧光信号得到放大，放大的荧光信号由检测器接收和分析，得到待测液的荧光信号峰；S5：将待测液换成DEPC水进行反应和检测，得到分子信标空白峰，待测液的荧光信号峰扣除分子信标空白峰即为目标miRNA的荧光信号峰。更进一步的，所述检测器为激光诱导荧光检测器。更进一步的，所述miRNA信号放大反应的反应条件为温度50-60℃，时间30-40min。优选的，所述上夹片和下夹片为载玻片。优选的，所述固定件为磁铁，活动部为铁片。本专利技术所述的用于miRNA检测的装置设计原理是将激光诱导荧光检测法(LIF)检测技术与纸芯片结合对miRNA进行检测。本专利技术开发的纸芯片用于进行DSN酶切放大反应，首先将DSN酶和分子信标固定在纸芯片上设置的反应单元，再将待测液加至反应单元，分子信标是针对目标miRNA设计的DNA单链，能与目标miRNA特异性结合，DNA单链一端连接荧光基团另一端连接猝灭基团，DSN酶能切割miRNA与分子信标形成的复合双链中的DNA链，使分子信标两端的荧光基团和猝灭基团相互远离，荧光得以恢复，释放后的miRNA又会结合新的分子信标，再次被DSN酶切割，反复作用后，荧光信号能得到有效放大；放大的荧光信号由激光诱导荧光检测器采集和分析，得到待测液的荧光信号峰，激光诱导荧光检测技术的灵敏度比普通荧光高1-3个数量级，其对荧光物质的检测限可以达到年nM数量级，甚至可以实现单分子检测，具有灵敏度高、快速、便捷、连续测量等优势，本专利技术将其与DSN酶切放大反应结合，灵敏度提高约5个数量级，检测限达到fM数量级，大大提高目标mi-RNA的检出率；采用DSN酶切放大反应，40min内就可以完成待测液中miRNA的检测，耗时短；且对样品的处理要求不高，所需的样品量少，5μL也能完成检测，节省样本。本专利技术装置包括反应组件和激光诱导荧光检测器组件，将纸芯片进行简单组装即可得到反应组件，与传统miRNA检测需要复杂的永久性仪器或装置相比，结构简单，不需要专业人员负责操作，大大降低设备和人力成本；纸芯片制作方便，能现制现用，设置的反应单元数量、大小和形状均可变，满足多种通量要求，适用于不同体积样本的检测，效率高、灵活度高。此外，本专利技术芯片-检测器检测接口的设置使得采集到的信号为峰形，易于判断；并有效缩短激光照射在纸上的时间，检测器中的光电管接收到的光子少，不易产生疲劳，因而重现性好。本专利技术的有益效果如下：相较传统的检测技术，不涉及复杂的程序或复杂的仪器，成本低，操作简单，方便快速。利用DSN酶切放大反应，结合激光诱导荧光检测技术，将灵敏度提高约5个数量级，检测限达到fM数量级；DSN酶切放大反应耗时短，特异性高，所需样本量少。开发的纸芯片可以完成DSN酶、分子信标的储存固定，酶切放大反应的进行，制作简单，能够满足多种通量要求，适用于不同体积样本的检测。附图说明图1：本专利技术所述用于miRNA检测的装置的结构示意图。图2：实施例1所述纸芯片的制作示意图。图3：实施例2所述A549细胞裂解液miRNA-31的检测结果。图4：实施例3所述不同浓度miRNA-31的检测结果。图中：1-芯片，2-透明夹片组，3-活动部，4-驱动件，5-检测器，11-反应单元，12-上层反应孔，13-下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于miRNA检测的装置，包括：/n－芯片，为miRNA信号放大反应的载体，设有若干反应单元；/n－透明夹片组，包括上夹片和下夹片，上夹片和下夹片叠合形成的一中间夹层，供所述芯片容置；/n－固定件，使上夹片、芯片和下夹片紧密贴合，彼此之间不发生相对位移；/n－活动部，设于透明夹片组下方，用于为反应单元提供可移动的检测接口；/n－检测器，设于活动部下方，用于接收和分析所述芯片反应单元的miRNA信号；/n－驱动件，与活动部连接并驱动其移动；/n其特征在于：/n所述活动部设有通孔，作为芯片-检测器检测接口，使驱动件带动活动部移动时，检测器的激发光能透过所述通孔照射到芯片反应单元，使反应单元miRNA信号得到激发而产生荧光，被检测器接收，通孔的大小至少能使激发光透过后在芯片的照射面积覆盖一个反应单元，通过活动部的移动，完成不同反应单元与检测器的对接。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA检测的装置，包括：
－芯片，为miRNA信号放大反应的载体，设有若干反应单元；
－透明夹片组，包括上夹片和下夹片，上夹片和下夹片叠合形成的一中间夹层，供所述芯片容置；
－固定件，使上夹片、芯片和下夹片紧密贴合，彼此之间不发生相对位移；
－活动部，设于透明夹片组下方，用于为反应单元提供可移动的检测接口；
－检测器，设于活动部下方，用于接收和分析所述芯片反应单元的miRNA信号；
－驱动件，与活动部连接并驱动其移动；
其特征在于：
所述活动部设有通孔，作为芯片-检测器检测接口，使驱动件带动活动部移动时，检测器的激发光能透过所述通孔照射到芯片反应单元，使反应单元miRNA信号得到激发而产生荧光，被检测器接收，通孔的大小至少能使激发光透过后在芯片的照射面积覆盖一个反应单元，通过活动部的移动，完成不同反应单元与检测器的对接。


2.根据权利要求1所述的用于miRNA检测的装置，其特征在于：所述芯片包括纸质基底和固态蜡薄层；通过将设计图案打印到所述纸质基底，加热使纸质基底上的固态蜡薄层融化并渗透到纸质基底中，形成对应设计图案的疏水化反应孔；所述设计图案为对称图案，使得芯片对折后上、下层反应孔重合，每一对重合反应孔为一反应单元。


3.根据权利要求2所述的用于miRNA检测的装置，其特征在于：利用所述反应单元进行miRNA信号放大反应并检测的方法如下：
S1：将分子信...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，蔡小玉，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35