一种T细胞无血清冻存液及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种T细胞无血清冻存液及其使用方法，该冻存液包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。本发明专利技术的冻存液无血清、无人源、无动物源成分，且化学成分明确，冻存液中DMSO含量低，克服了现有技术中高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响，并且对T细胞的冻存性能优异，T细胞冻存后复苏的活率在90%以上，不影响后续的激活和扩增，具有更高的临床应用和科研价值。

A serum-free cryopreservation solution for T cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种T细胞无血清冻存液及其使用方法
本专利技术属于细胞冻存领域，具体涉及一种化学成分明确的无血清、无人源、无动物源成分的T细胞冻存液及其使用方法。
技术介绍
T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。在这个过程中，需要对扩增前、扩增中和扩增后的T细胞进行冷冻保存和复苏操作，以便保证随时进行研发、实验、测试、使用等目的。细胞冻存及复苏是细胞培养技术中的重要技术，一般是指将细胞或组织置于-196℃液氮中进行低温保存，使其暂时脱离生长状态，并长久保存其生物性能。常用的细胞冻存方法包括慢速冻存和玻璃化冻存。慢速冻存是指采用"慢冻快融"的方法进行的冻存和复苏操作。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。细胞冻存液是指在进行细胞冻存时必需用到的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮于冻存液，供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。传统的T细胞冻存液包含一定比例的血清，细胞培养液，二甲基亚砜DMSO（通常为10%）。这种冻存液的问题在于：1）血清批次间差异导致冻存效果不稳定；2）含异种动物（一般为牛）来源的血清成分，存在引入异种动物病原体感染的风险，不能直接用于临床；3）血清成分复杂，其中含有多种蛋白、生长因子等，对一些种类的细胞不但达不到最佳冻存效果，还可能影响细胞后续的生长状态；4）不适合与无血清培养体系同时使用。现有的商业化T细胞无血清冻存液存在以下问题：1）配方成分复杂，需要添加一种或几种除DMSO以外的冻存保护剂；2）大部分需添加人血清来源的人源白蛋白，增加了成分的复杂程度、原料来源的不稳定性及生产制造的难度，不能做到真正的化学成分明确，临床使用具有很大的不确定性。
技术实现思路
本专利技术目的是为了克服现有技术的不足而提供一种改进的T细胞无血清冻存液。本专利技术的另一目的是提供上述T细胞无血清冻存液的使用方法。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种T细胞无血清冻存液，包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。根据本专利技术的一些实施方面，按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~50mg/L、转铁蛋白5~100mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C1~100mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。根据本专利技术的一些优选实施方面，按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~10mg/L、转铁蛋白5~50mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C5~50mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。优选地，所述细胞膜稳定剂为PluronicF-68、KolliphorP188中的一种或二者组合。在配方中加入可用于临床注射制剂的特定细胞膜稳定剂，使得DMSO的含量可以低至2%，克服了现有技术高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响。根据本专利技术的一些优选实施方面，所述胰岛素为重组人胰岛素。根据本专利技术的一些优选实施方面，所述转铁蛋白为重组人转铁蛋白。根据本专利技术的一些优选实施方面，所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。优选地，所述重组人血清白蛋白为酵母表达的重组人血清白蛋白（rHSA），从而完全去除人源组分，做到真正的化学成分明确。根据本专利技术的一些实施方面，所述冻存保护剂为DMSO，其添加体积量占所述冻存液总体积的2~10%。优选地，所述冻存保护剂的添加量为2%或5%。低DMSO含量的冻存液克服了现有技术高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险。根据本专利技术的一些实施方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM、DMEM/F12、aMEM、RPMI1640、M199中的一种或几种的混合。根据本专利技术的一些优选实施方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM/F12、RPMI1640中的二种或三种的混合物。根据本专利技术的进一步优选方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM/F12、RPMI1640三者的混合物。优选地，所述IMDM、DMEM/F12、RPMI1640三者的体积比为1：1：1。根据本专利技术的进一步优选方面，所述基础培养基为DMEM/F12、RPMI1640二者的混合物。优选地，所述DMEM/F12、RPMI1640二者的体积比为1：1。本专利技术采用的另一技术方案为：上述所述的T细胞无血清冻存液的使用方法，所述使用方法包括将新鲜分离提取或正在扩增培养中的T细胞在离心管离心沉淀，去除上清液，然后将所述冻存液加入所述离心管中，重悬，得到细胞重悬液，将所述细胞重悬液转移到冻存管中，然后置于-78℃~-82℃冻存12~24h，然后再转入液氮中保存。本专利技术所述的T细胞冻存是专指针对T细胞的慢速冻存。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术的冻存液无血清、无人源、无动物源成分，且化学成分明确，冻存液中DMSO含量低，克服了现有技术中高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响，并且对T细胞的冻存性能优异，T细胞冻存后复苏的活率在90%以上，不影响后续的激活和扩增，具有更高的临床应用和科研价值。本专利技术的冻存液相比使用盐离子缓冲液或生理盐水作为基础配方的冻存液，本专利技术使用细胞基础培养基作为冻存液的基本配方，提供了细胞代谢活动所需的多种营养物质，同时具有适合细胞存活的pH缓冲能力，可以有力支持细胞冻存复苏的高活率。附图说明图1为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后计数所得的存活率示意图。图2为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第0天的细胞示意图。图3为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第3天的细胞示意图。图4为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第3天的细胞计数的数据对比示意图。图5为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后计数所得的存活率示意图。图6为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后激活培养6天的细胞示意图。图7为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后激活培养6天的细胞计数的数据对比示意图。具体实施方式本专利技术针对现有的T细胞商品化冻存液和传统冻存液存在的问题，提供一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T细胞无血清冻存液，包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，其特征在于：所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种T细胞无血清冻存液，包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，其特征在于：所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。


2.根据权利要求1所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~50mg/L、转铁蛋白5~100mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C1~100mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。


3.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述胰岛素为重组人胰岛素。


4.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述转铁蛋白为重组人转铁蛋白。


5.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。


6.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述细胞膜稳定剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛涛，陈旭，陈刚，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32