用于眼部病症的基因疗法制造技术

本发明专利技术提供了用于治疗受试者的莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)的组合物和方法。一方面，提供了重组腺相关病毒载体，其包括包含编码Lebercilin的序列的核酸分子。另一方面，Lebercilin具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。又一方面，所述核酸分子具有序列SEQ ID NO:3或其变体。在所需实施方案中，所述受试者为人、猫、狗、绵羊或非人灵长类动物。

Gene therapy for eye diseases

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于眼部病症的基因疗法关于联邦政府资助的研究或开发的声明本专利技术是在由国家眼科研究所(NEI)/国立卫生研究院(NIH)所授予的批准号R21EY020662和P30EY001583下借助政府资助完成。政府享有本专利技术中的某些权利。以引用的方式并入以电子形式提交的材料申请人在此将以引用的方式并入以电子形式提交的序列表材料。此文件标记为“UPN-16-7696PCT_Seq_Listing_ST25.txt”。
技术介绍
莱伯氏先天性黑蒙症(LCA；OMIM204000)是最严重的遗传性致盲疾病之一。LCA是罕见的，发生在1:50,000的个体中，通常以常染色体隐性方式遗传，并可由至少22个不同基因中的任一个中的突变引起(sph.uth.edu/RetNet/sum-dis.htm)。临床特征包括婴儿期或儿童早期的视力严重异常(视力下降、视野缩小)、眼球震颤、及生命早期出现的不良视力的进行性丧失。临床试验揭示消失的暗适应和明适应视网膜电图(ERG)反应、黑蒙性瞳孔、光敏度降低、及视网膜中的色素改变。当前没有批准用于LCA的治疗。由视网膜色素上皮65kDa蛋白编码基因RPE65中的突变引起的LCA形式(RedmondTM,YuS,LeeE,BokD,HamasakiD,ChenN等人Rpe65isnecessaryforproductionof11-cis-vitaminAintheretinalvisualcycle.NatGenet(1998)20(4):344-51；RedmondT,HamelC.GeneticanalysisofRPE65:fromhumandiseasetomousemodel.MethodsinEnzymol(2000)317:705-24，它们都以引用的方式并入本文)近年来由于其已成为多基因增强疗法临床试验的靶标而备受关注。通过使用腺相关病毒(AAV)血清型2，若干研究小组已证实将RPE65cDNA的野生型拷贝递送到视网膜色素上皮(RPE)是安全的，并且这可逆转包括夜盲在内的许多缺陷。(3-9)测试AAV2-hRPE65v2的随机、多中心3期研究(或voretigeneneparvovec，由SparkTherapeutics,Philadelphia,PA主办)，已证实此试剂的视网膜下注射引起光敏度、视野及甚至能够在一定的亮度条件下使用视觉线索进行精确且快速导航的能力的改善。(10,11)美国食品和药物管理局(FDA)于2017年12月19日批准了Voretigeneneparvovec-rzyl的药物，使其成为美国首批批准的基因疗法药物之一。在开发针对由RPE65突变LCA2引起的LCA的治疗方面的进展为开发针对其他形式的早期发作视网膜变性的治疗铺平了道路，所述其他形式中的大多数是由光感受器特异性基因而不仅是RPE特异性基因的突变引起。这种已经很严重的病状(LCA)最严重的形式之一是由编码Lebercilin的光感受器特异性基因LCA5的突变引起(12-20)。据估计，LCA5突变约占LCA病例的2％，尽管它可能在基因分离的群体中更为普遍。(16)LCA5突变也被认为是视网膜变性的其他早期发作形式的原因，所述其他早期发作形式包括视锥营养不良和常染色体隐性色素性视网膜炎(ARRP)。(15、16、21)因此，需要适用于在有此需要的受试者中表达Lebercilin的组合物。
技术实现思路
本文所述的实施方案涉及关于用于将人LCA5递送给有此需要的受试者的AAV基因疗法载体的组合物和方法，在所述载体经玻璃体内或视网膜下施用后产生莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)的长期、可能是10年或更长时间的临床上有意义的修正。一方面，提供了一种编码人Lebercilin的密码子优化的、工程化核酸序列。在一个实施方案中，密码子优化的核酸序列是SEQIDNO:3或SEQIDNo:2的变体。在另一实施方案中，密码子优化的核酸序列是SEQIDNO:3。在另一实施方案中，核酸序列是为在人中的表达而优化的密码子。另一方面，提供了一种表达盒，其包含编码Lebercilin的密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达盒包含编码人Lebercilin的核酸序列SEQIDNO:3。在另一些实施方案中，Lebercilin编码序列位于5’与3’AAVITR序列之间。另一方面，提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体。所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组。在一个实施方案中，所述载体基因组包含：(a)AAV5'反向末端重复(ITR)序列；(b)启动子；(c)编码人Lebercilin的编码序列；及(d)AAV3'ITR。在一个实施方案中，rAAV载体还包含指导Lebercilin在宿主细胞中的表达的表达控制序列。在其他实施方案中，Lebercilin序列是蛋白质序列SEQIDNO:1。在一个实施方案中，载体基因组是SEQIDNO:8的nt1-4379的序列。在另一实施方案中，载体基因组是SEQIDNO:9的nt1-4368的序列。在又一个实施方案中，用如本文所述的另一LCA5编码序列交换任一个所鉴别的载体基因组中的LCA5编码序列。另一方面，提供了一种适用于向LCA患者施用的水性混悬液。在一个实施方案中，混悬液包含水性助悬液体和每眼约1x1010个本文所述适用作LCA治疗剂的重组腺相关病毒(rAAV)的GC或病毒粒子至约1x1013个GC或病毒粒子。另一方面，一种药物组合物包含药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂和核酸序列、质粒、载体或病毒载体，如本文具体描述的rAAV。另一方面，一种用于在患有LCA的哺乳动物受试者中治疗由lebercilin基因(LCA5)缺陷引起的莱伯氏先天性黑蒙症和/或恢复视觉功能的方法包括经由玻璃体内、视网膜下或血管内注射向有此需要的受试者递送如本文所述的编码Lebercilin的重组AAV载体。另一方面，提供了如本文所述的AAV载体在患有LCA的哺乳动物受试者中治疗由lebercilin基因(LCA5)缺陷引起的莱伯氏先天性黑蒙症和/或恢复视觉功能中的用途。所述用途包括经由玻璃体内、视网膜下或血管内注射向有此需要的受试者递送如本文所述的编码Lebercilin的重组AAV载体。本专利技术的其他方面和优点将易于由以下专利技术详述变得显而易见。附图说明图1A示出了用于产生如本文所述的AAV7m8.CBA.hopt.LCA5和AAV7m8.CBA.EGFP的转基因盒。图1B-1D提供了LCA5(天然_LCA5)的人核酸序列SEQIDNO:2与密码子优化的LCA5(密码子优化的_LCA5)序列SEQIDNO:3的比对。图1E-1F提供了pAAV.CMV.CBA.人密码子优化的Lebercilin载体的质粒图和特征列表。核酸序列在SEQIDNO:8中重现。图1G-1H提供了在P5时用AAV7m8-hopt-LCA5注射且在P15时分析的眼睛的免疫荧光分析，示出了如实施例1、2和4中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种密码子优化的、工程化核酸序列SEQ ID NO:3，其编码人Lebercilin。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170301 US 62/465,649;20170310 US 62/469,6421.一种密码子优化的、工程化核酸序列SEQIDNO:3，其编码人Lebercilin。


2.一种表达盒，其包含编码人Lebercilin的密码子优化的核酸序列SEQIDNO:3。


3.一种重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含：
(a)AAV5'反向末端重复(ITR)序列；
(b)启动子；
(c)编码人Lebercilin的编码序列；
(d)AAV3'ITR。


4.根据权利要求3所述的rAAV，其中(c)的所述编码序列是密码子优化的人LCA5，其与天然人Lebercilin编码序列SEQIDNO:2具有至少70％同一性。


5.根据权利要求3或4所述的rAAV，其中(c)的所述编码序列是SEQIDNO:3。


6.根据权利要求3至5中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV衣壳是AAV7m8或其变体、AAV8衣壳、AAV6衣壳或其变体、AAV9衣壳或其变体、AAV7衣壳或其变体、AAV5衣壳或其变体、AAV2衣壳或其变体、AAV1衣壳或其变体、AAV3衣壳或其变体、或AAV4衣壳或其变体。


7.根据权利要求3至6中任一项所述的rAAV，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子或包含CMV启动子序列和鸡β肌动蛋白(CBA)启动子序列的杂合启动子。


8.根据权利要求3至7中任一项所述的rAAV，其中所述AAV5'ITR和/或AAV3'ITR是来自AAV2。


9.根据权利要求3至8中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组还包含polyA。


10.根据权利要求3至9中任一项所述的rAAV，其还包含内含子。


11.根据权利要求3至10中任一项所述的rAAV，其还包含增强子。


12.一种组合物，其包含权利要求3-11中任一项所述的rAAV和适用于向眼部递送的药学上可接受的载剂或赋形剂。


13.一种适用于向LCA患者施用的水性混悬液，所述混悬液包含水性助悬液体和每眼约1×1010个重组腺相...

【专利技术属性】
技术研发人员：琼·贝内特，珍妮特·班尼切利，孙俊伟，宋知伦，塞奇·尼科诺夫，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州立大学托管会，
类型：发明
国别省市：美国;US