一种快速分离免疫磁珠的方法技术

本发明专利技术公开了快速分离免疫磁珠的方法，可应用于化学发光仪和核酸提取仪。是将包被抗体/抗原的免疫磁珠和标记物标记的抗体/抗原以及待测物在反应杯中孵育；反应结束后，加入小型永小型永磁体吸附免疫磁珠，使抗原‑抗体‑磁珠免疫复合物从反应液中分离；清洗液清洗后加入发光底物/激发系统促使反应杯内发光物质释放光子，进行光子计数检测发光强度。本发明专利技术将小型永磁体置入反应液内，使永小型永磁体和反应液中的免疫磁珠直接接触，在极短时间（3‑15s）内实现快速分离。分离速度快，效率高，免疫磁珠流失率大幅度降低，并且大大简化了仪器设计过程中磁分离模块的结构，缩短了免疫磁珠从反应液中分离和清洗的时间。

【技术实现步骤摘要】
一种快速分离免疫磁珠的方法
本专利技术涉及一种快速分离免疫磁珠的方法，由小型永磁体在反应杯外部变为反应杯内部，属于免疫学检测领域。
技术介绍
免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。化学发光是体外诊断行业最重要的细分之一，其在免疫学检验方面的应用日益受到人们的重视，该法具有高灵敏度、宽线性、反应快速，影响因素少，结果准确等优点，各种化学发光的标记物如下：直接化学发光，标记物为吖啶酯(雅培)或者ABEI(新产业)；酶促化学发光，标记物为碱性磷酸酶(厦门波生)或者辣根过氧化物酶(强生)；电化学发光，标记物为三联吡啶钌(罗氏)。基于磁性颗粒的化学发光技术是免疫诊断中更为先进的检测技术，也是目前化学发光免疫检测的主流。免疫磁性微球可以简单快速地从血液或者骨髓中富集、清除癌细胞，广泛地应用于疾病检测、癌症治疗和自身骨髓移植中，还被用于从母体外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断。免疫磁珠分离技术用在微生物检测方面能准确快速地检测出样品中的ColiO157，这对于食品卫生和预防疾病的传播具有重要的意义。磁珠内部含有人工合成的磁核，可被磁铁磁力所吸引；外部接枝功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)，作为固相载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。图1是传统磁分离装置结构示意图；其磁分离装置是一个机械臂固定小型永磁体，在反应杯内反应液孵育时，远离反应杯；孵育结束后，机械臂移动小型永磁体至反应杯侧面，将抗原-抗体-磁珠免疫复合物从反应液中分离。图5是公开号为CN105758848A，名称为应用于化学发光测定的温育磁分离装置的机械臂-磁铁装置；图6是公开号为CN208019096U，名称为一种用于发光免疫磁分离清洗装置的机械臂-磁铁装置。总之，永磁铁或者电磁铁在发光管或者酶标板外侧运作。我们知道，对同一种磁微粒进行磁分离，磁场强度越强，分离越快，用时越短。根据如下电磁场强度公式，磁场强度与磁铁磁性成正比，与磁路长度成反比。由于磁铁与反应杯侧面接触，与反应液中的磁微粒最短距离是隔着反应杯壁，最长距离是反应杯壁厚度加内径，平均磁路长度较大，导致反应杯整体磁场强度较弱，磁分离用时约3min。目前所使用的强力永磁体充磁量基本达到上限，若继续增加磁力，其技术难度和成本均大大增加（即相当于公式中N*I基本趋于定值）。因此在磁力不变的情况下，有效缩短磁路长度，是实现快速磁分离的有效手段。磁分离后，除去反应液，加入清洗液清洗，反复清洗5次。由于抗原-抗体-磁珠免疫复合物被磁铁吸附的不够牢固，每次加入清洗液过程中，会将复合物冲散一部分，避免抗原-抗体-磁珠免疫复合物损失，除去洗液前，要继续磁分离1min以上，这样整个检测过程（反应孵育+注液+磁分离+洗液）用时至少10min以上。当然这对传统的常规测试速度（20-40分钟）的化学发光检测方式影响不是太大，但是对快速化学发光（3-7min）严重影响了其测试速度。因此，要想尽快获得检测结果，缩短抗原-抗体-磁珠免疫复合物的磁分离时间和清洗时间是其中的关键。
技术实现思路
目前化学发光仪器所采用的磁分离方法主要是将永磁铁/电磁铁置于反应杯外侧，属于非接触磁分离，由于磁铁与反应液的距离相对较大，再加上反应杯壁的厚度，导致磁性微粒磁分离时间较长、且分离效果较差。为了克服目前化学发光仪的缺点，本专利技术提供了一种快速分离免疫磁珠的方法，由磁铁装置在反应杯外部改变为将小型永磁体置于反应杯内部，分离速度快，效率高，缩短了反应液磁分离和清洗的时间，有助于临床的快速判断，简化了仪器设计过程中磁分离模块的结构。为了实现上述专利技术目的，本申请采用了以下技术方案：一种快速分离免疫磁珠的方法，步骤如下：（1）、反应杯内加入免疫磁珠、标记抗原/抗体和待测物，进行孵育，获得抗原-抗体-磁珠免疫复合物；所述反应杯可以是单个或者连在一起的发光管和酶标板，以及其他相似的反应容器；小型永磁体是根据反应杯大小选择，直径0.05-10mm；小型永磁体是裸露的小型永磁体，也可以是表面包覆一层保护层的小型永磁体；保护层可以是聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、尼龙塑料、ABS塑料等聚合物包覆层，可以是特氟龙、陶瓷、油漆等涂层，可以是铜、银、金、铂等镀层，以及其他类似的保护层物质。小型永磁体形状不限，可以是球形、橄榄球形、柱状体、锥形体、星状体、芒状体、簇状体、规则和不规则多面体等。磁铁种类不限，可以是永久性磁铁，可以是钐钴小型永磁体、钕铁硼磁铁(强力磁铁)、铁氧体磁铁、铝镍钴磁铁、铁铬钴磁铁。所述抗原/抗体可以是动物源、人源、基因重组表达的完全和部分抗原/抗体；标记抗体的标记物可以是生物素、同位素、酶、发光物质和荧光物质的一种；例如：标记同位素是3H、18O、42K、131I、35S、32P、15N等。例如：标记荧光物质是FITC、稀土元素配合物、CY系列和Alexa系列荧光类蛋白染料的一种或者几种。例如：标记生物酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等；（2）、反应结束后，在反应杯内部加入永小型永磁体，将原先分散在反应液中的结合样本和标记抗原/抗体的免疫磁珠（抗原-抗体-磁珠免疫复合物）在反应液中聚集；（3）、经清洗液清洗，分离，加入发光底物溶液或者激发物溶液使反应杯内的发光物质释放光子，化学发光仪测定光子量，记录发光值，获得标准曲线，根据标准曲线，获得样品的含量。所述的发光底物溶液为AMPPD-增强剂或者CSPD-增强剂（碱性磷酸酶），鲁米诺-H2O2-增强剂溶液（辣根过氧化物酶）；所述的激发物溶液可以是硝酸-H2O2/NaOH-表面活性剂，二丁基乙醇胺溶液；本专利技术将小型永磁体放置在充分反应后的反应杯内部的反应液内，小型永磁体和反应液直接接触，在磁力作用下，磁微粒小型永磁体结合，两者的最大距离为反应杯内径的一半，平均磁路长度小，反应杯内整体磁场很强，完全磁分离用时仅为3-10s。由于小型永磁体与抗原-抗体-磁珠免疫复合物结合牢固，加或者弃去洗液时不会冲散复合物，加完洗液无需磁分离时间，可立即除去清洗液，大大缩短了清洗时间，整个检测过程（孵育+磁分离+清洗）用时在3-5min以内。本专利技术的直接接触式快速磁分离方法，适用于管式化学发光仪、板式化学发光仪、核酸提取仪等仪器平台。传统的外置磁铁磁分离方法对仪器的磁分离模块要求比较高，不但需要设置机械臂控制磁铁运行轨迹，还需配套软件程序，结构复杂，成本较高。而本专利技术内置磁铁磁分离方法，只需在反应杯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速分离免疫磁珠的方法，其特征在于，步骤如下：/n（1）、将免疫磁珠、标记物标记的抗原/抗体和待测物置于反应杯内，进行孵育，使其形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物；/n（2）、孵育结束后，在反应杯中的反应液内加入小型永磁体，在3-15秒内结合有标记的抗原/抗体和待测物的免疫磁珠抗原-抗体-磁珠免疫复合物吸附到小型永磁体表面，实现从分散到聚集的过程；/n（3）、经清洗液清洗，加入发光底物溶液或者激发物溶液，促使反应杯内发光物质释放光子，进行光子计数检测发光强度， 通过标准曲线计算待测物含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速分离免疫磁珠的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、将免疫磁珠、标记物标记的抗原/抗体和待测物置于反应杯内，进行孵育，使其形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物；
（2）、孵育结束后，在反应杯中的反应液内加入小型永磁体，在3-15秒内结合有标记的抗原/抗体和待测物的免疫磁珠抗原-抗体-磁珠免疫复合物吸附到小型永磁体表面，实现从分散到聚集的过程；
（3）、经清洗液清洗，加入发光底物溶液或者激发物溶液，促使反应杯内发光物质释放光子，进行光子计数检测发光强度，通过标准曲线计算待测物含量。


2.根据权利要求1所述的快速分离免疫磁珠的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的标记物为诸如吖啶酯类、鲁米诺类、过氧草酸酯类、三联吡啶钌类之发光物质，诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶之酶类。


3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宇腾，
申请(专利权)人：姜宇腾，
类型：发明
国别省市：山东;37