一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用。FMR1基因PCR扩增反应检测方法包含至少四种引物，至少一种以上增强剂，对FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列进行扩增。同时此FMR1基因PCR扩增方法应用于脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒，通过PCR扩增、毛细管电泳分析PCR产物，该试剂盒能对高CGG重复序列进行精确定量分析，方法简单、快速、准确的检测方法，只需要一次PCR实验即可检测出CGG重复数的变异情况，从DNA样本开始，6小时内可以出结果，检测技术流程简单，容易实现标准化。

A method for detecting CGG repeat of FMR1 gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因PCR扩增方法与脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒及其应用。
技术介绍
脆性X综合症是仅次于唐氏症，造成智能障碍的第二原因，然而大部分的唐氏症不会遗传，但脆性X综合症是一种性联遗传性疾病。脆性X综合症具有范围广泛的病征，从轻微的学习障碍到严重智能障碍都有可能发生。除了智能障碍外，其他可能的现象包括:情绪问题、语言迟缓、注意力不集中、过动、自闭、不善与人接触等。根据统计，此症男性发生率约1/4,000，女性的发生率约1/5,000-1/8,000。致病的原因是FMR1基因内5’端非转录区发生CGG重复次数异常增加，导致FMRP基因产物的缺失或减少，FMRP是一种重要的脑部物质，为RNA结合蛋白，可调节许多突触蛋白的合成，缺乏时会会影响大脑发育和功能异常。美国医学遗传学会(ACMG)依据FMR1CGG重复次数，定义出CGG重复次数小于45为“正常型”、CGG重复次数45-54为“中间型”、CGG重复次55-200为“前突变型”及CGG重复次数大于200为“全突变型”等，“正常型”和“中间型”不会有临床症状，“前突变型”称之为携带者，“全突变型”就会成为患者。当CGG重复中出现AGG能帮助预测对于CGG重复次数遗传至下一代时，CGG重复是否有扩展的风险。80%脆性X综合症病人有家族病史，家族成员是此症的高风险族群，遗传机率高达二分之一。在脆性症的患者中，20%并没有家族史，是由为没有症状的“前突变型”的母亲所生下。当带因者的CGG重复次数越多，下一代的就有越高的风险生下患者。一旦超过200次就会发病，因此女性带因者最多会有50%的机会生下脆性症宝宝；男性带因者的FMR1基因变异会遗传给女儿，而不会传给儿子。带因父亲所生的女儿也是携带者，她的智力虽然正常，但她所生的小孩却有生下脆性症宝宝的风险。目前脆性X综合症常见的分子检测方法为印迹杂交法（SouthernBlot）、聚合酶链式反应扩增法（PolymeraseChainReaction,PCR）。印迹杂交法能确定较大CGG重复序列的数目，并能评估FMR1基因的甲基化程度，但DNA需要量大，且对CGG重复较少的前突变型或者嵌合型样本，可能漏检或误诊，无法准确定值CGG重复数，同时因为操作繁琐，费时费力，对实验设备和人员培训要求较高，一般实验室难于实现。基于PCR扩增FMR1基因，毛细管电泳检测扩增片段比传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率更高，但由于扩增片段CG比例太高，难度随着重复数次数的增加，通常大部分的PCR引物的设计，因为PCR反应体系未能调整至最佳条件，当遇到前突变型和全突变型，或者正常型和全突变型，这类嵌合型的样本，通常未能检测出全突变型的片段，可能导致检测结果误判。较新的检测方法是重复引物PCR技术，又称为三引物PCR法(Tripletrepeat-primedPCR,TP-PCR)。1996年Warner等专利技术此种方法用以诊断DM1超大片段(CAG重复异常)动态突变患者。TP-PCR法有别于传统PCR扩增，其反应中加入3个引物。FMR1基因的TP-PCR法在一般的PCR扩增基础下，新增了CGG序列引物，可以作为全突变型的辅助诊断，确认是否含有全突变的片段，解决了一般PCR在大片段扩增效率较差而误判的问题，但CGG的扩增效率太高，会抑制大片段的反应，同时定量的校准品跨度不够宽，对于较大重复数不能进行精确定量分析，可能还是有误判的风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种FMR1基因PCR扩增方法与脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒及其应用，对于高CGG重复数样本的检测更为灵敏，同时能准确定量，更快速的完成检测，有效地减少操作人员的工作量，降低检测成本。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物位于FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列外的上游与下游，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列。一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物为包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列组成的上游与下游引物，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列。第三引物在PCR扩增反应中的终浓度低于第一引物、第二引物与第四引物在PCR扩增反应中的终浓度至少1000倍。第三引物的CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列，包含4到7个CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列。所述四种引物中至少一种引物包含荧光修饰。所述的第一引物与第二引物包括以下序列：第一引物P1：5’-CGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC-3’;第二引物P2：5’-GTAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACT-3’;所述的第三引物与第四引物包括以下序列：第三引物P3：5’-CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTCCGGCGGCGGCGGCGG-3’;第四引物P4：5’-CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTC-3’;其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。所述的第三引物与第四引物包括以下序列：第三引物P5：5’-TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTCGGCGGCGGCGGCGG-3’;第四引物P6：5’-TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT-3’;其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。所述的第一引物与第二引物包括以下序列：第一引物P7：5’-GCACGCTCCTGCACAGCCTCCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC-3’;第二引物P8：5’-GCACGCTCCTGCACAGCCTCAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA-3’;其中划单线部分为非人源性基因组序列。所述的第一引物与第二引物包括以下序列：第一引物P9：5’-ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC-3’;第二引物P10：5’-ACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC-3’;其中划单线部分为非人源性基因组序列。所述PCR扩增反应所使用的PCR反应液包含增强剂，所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，其特征在于：利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物位于FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列外的上游与下游，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，其特征在于：利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物位于FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列外的上游与下游，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第三引物的非人源性基因组序列。


2.一种FMR1基因CGG重复数的PCR扩增反应检测方法，其特征在于：利用四种不同引物进行PCR反应，第一引物与第二引物为包含FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列以外的序列与非人源性基因组序列组成的上游与下游引物，第三引物含CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC序列重复序列与非人源性基因组序列，第四引物包含第一引物、第二引物和第三引物的非人源性基因组序列。


3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，第三引物在PCR扩增反应中的终浓度低于第一引物、第二引物与第四引物在PCR扩增反应中的终浓度至少1000倍。


4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，第三引物的CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列，包含4到7个CGG、GGC、GCG、CCG、GCC或CGC重复序列。


5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述四种引物中至少一种引物包含荧光修饰。


6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述的第一引物与第二引物包括以下序列：
第一引物P1：5’-CGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC-3’;
第二引物P2：5’-GTAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACT-3’。


7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P3：
5’-CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTCCGGCGGCGGCGGCGG-3’;
第四引物P4：5’-CTCGACGCACGCTCCTGCACAGCCTC-3’;
其中划单线部分为非人源性基因组序列，加粗部分为CGG重复序列。


8.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的第三引物与第四引物包括以下序列：
第三引物P5：
5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亦亦，萧羽乔，邱一帆，钟丽霞，李淑如，
申请(专利权)人：胜亚生物科技厦门有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35