一种信使RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种信使RNA的提取方法，其中，所述提取方法将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术转染至胚胎内，待生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术，获得纯化的信使RNA。本发明专利技术采用子宫内胚胎点转染技术和翻译核糖体亲和纯化技术相结合，根据大脑皮质不同板层神经元发育的时间特性，在特定时间和脑区上标记特定的神经元，并取发育过程中的不同时间点进行实验，以期取得发育期动态分子库构建翻译谱，为总结规律，发现特定关键因子，筛选有效基因打下坚实基础。

A method of extracting messenger RNA

【技术实现步骤摘要】
一种信使RNA的提取方法
本专利技术涉及一种信使RNA的提取方法，属于生物

技术介绍
哺乳动物的大脑新皮层是一种复杂的、具有高度组织性的结构，由6层不同类型的板层(layer)组成，其间由数百种不同类型的神经元细胞和神经胶质细胞。大脑新皮层是负责认知功能、感官知觉和意识的大脑区域，在进化过程中经历了显著的扩充和发展。在发育过程中，各板层具有固定的发育顺序和时间，并按时间顺序产生不同板层的特点神经元。神经元发育是基于中心法则，将遗传物质通过转录和翻译，最终产生蛋白质，发挥生物学作用，通过其各过程的复杂编排组合，以获得特定的细胞身份。决定特定神经元发育的最终类型及其所具备的功能作用是由基因组控制的，但由于神经元发育过程中时间及空间方面的复杂性，给这类研究造成了巨大障碍。寻找大脑新皮质中这种多样性和特异化的神经元的起源，发现形成和维持神经元多样性的规律，是目前亟待解决的科学问题。目前对于神经元发育过程的研究大多集中在转录层面，通过提取全脑或者全皮质组织中的RNA，进行转录谱学分析。尽管通过生物信息学分析可以从转录谱中发现一些神经发育过程中的分子变化规律，但是同时其具有一些局限性，其中比较重要的：第一，由于神经元发育的时间性和空间性特点，常规组织样本提取方法取样较杂，包含多个区域、皮质板层及细胞类型，无法对特定区域，特定板层，或特定的神经元亚型进行归类性分析研究；第二，转录谱为转录水平的研究，研究的是细胞总RNA，里面既含有可以在翻译时编码蛋白质的外显子(exon)，也含有非编码性的内含子(Intron)，由于存在转录后修饰，翻译及翻译后修饰等一系列生物反应，因此其对最终发挥生物学效应的蛋白质变化规律并不能很好地反应。而解决这一挑战需要高质量的神经元亚类纯化方法，并考虑神经元动态、多层的特点，在转录翻译期间采集神经元并进行整合分析。同时也需从相同组织获得多种神经元亚型的组合谱以更好地理解形成复杂网状联系的调节通路。目前，已经通过各种遗传学及手术的方式来尝试解释新皮质的复杂性和不同表征神经元细胞类型的问题，然而标记和纯化并定义神经元亚型仍然具有挑战性，因为在皮质发育过程中，特异性标记物总是动态变化的。因此，急需一种准确提取神经元样本的方法，便于对神经元发育进行精准的检测与研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以荧光质粒标记的核糖体为基础，收集与标记核糖体结合的信使RNA，获得一种提取正在进行翻译的信使RNA的信使RNA的提取方法。为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的信使RNA的提取方法的技术方案如下：本专利技术的提取方法通过将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术(IUE)转染至小鼠胚胎内，在小鼠生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术(TRAP)，获得纯化的信使RNA(mRNA)。本专利技术采用将子宫内胚胎电转染技术和翻译核糖体亲和纯化技术相结合的方式，可以对特定对象在特定时间的胞内核糖体进行提取和检测，本专利技术以神经发育的研究作为目的，以特定神经层中的mRNA作为提取对象进行提取，小鼠仅为常规实验客体，但本专利技术的方法不应限于对小鼠神经细胞中mRNA的提取。IUE技术可以在活体状态下对目标质粒进行转染，成功率高且不影响转染后的活体生长发育，为研究生长发育状态等科研方向奠定了更为坚实的技术基石。TRAP的技术优势在于：能够在不分选细胞的情况下原位提取特定细胞类型中mRNA；TRAP提取的是细胞中正在进行翻译的mRNA，比总RNA更能准确代表细胞内蛋白翻译情况；TRAP技术提取的不仅是神经元胞体的mRNA，还包括轴突、树突和棘突的mRNA。优选的，所述标记核糖体的质粒为pUBC-EGFP-L10a。本专利技术中的质粒使用在神经元中高表达的人UBIQUITINC为启动子，其后添加EGFP-L10a结构域。小鼠子宫内胚胎电转染技术采用两个质粒进行共转染。由于单独转染EGFP-L10a质粒时，荧光强度较弱，无法在解剖荧光显微镜下检验活体内转染建模成功与否，因此我们选取pCAG-tdTomato质粒(表达红色荧光)进行共转染，tdTomato荧光强易于检验并可标记区域，还能为荧光下显微解剖特定脑区提供范围标记。而且两种质粒共转染其效率可达90％以上。因此优选的，共转染的质粒为pUBC-EGFP-L10a和pCAG-tdTomato质粒。作为一种优选的实施方式，共转染时一同加入细胞染色液。更优选的，细胞染色液选自：固绿(fastgreen)、苏木精(hematoxylin)或亚甲基蓝染液。为能直接观察到质粒溶液被准确顺利的注入小鼠胚胎大脑的侧脑室内，我们一并加入细胞染色液在质粒混合溶液内。优选为fastgreen，其呈蓝色，无毒害及副作用，并可在数小时内消散干净。本专利技术中的翻译核糖体亲和纯化技术以抗GFP抗体的磁珠吸附小鼠大脑皮层核糖体上正在翻译的mRNA，纯化后获得mRNA。本专利技术的提取方法主要针对小鼠大脑皮层layerⅡ/Ⅲ中的神经元进行mRNA提取，该层神经元主要在胚胎期E15.5天产生，因此利用这一发育周期，针对E15.5天的小鼠胚胎进行IUE处理，特异性标记我们想要研究的layerⅡ/Ⅲ内的神经元，并将目标质粒pUBC-EGFP-L10a转染入小鼠胚胎内进行验证，待子代小鼠出生后，选取建模成功的子代小鼠进行后续验证实验。在小鼠胚胎期E19-E20天时子代小鼠出生，一窝子代小鼠全部出生完毕后立即在解剖荧光显微镜下检测建模是否成功，及建模质量。建模完成待子代小鼠出生后，我们选取P0/P7/P14这三个时间点进行后续TRAP实验。具体的，所述提取方法包括如下步骤：a)取怀孕小鼠暴露小鼠胚胎，将质粒溶液注射入暴露的小鼠胚胎脑内；b)电极头端夹住小鼠胚胎脑部两侧，电转仪脉冲刺激脑部，刺激后恢复体内培养；c)小鼠出生后冰浴取脑，冰上解剖目标皮层区域，裂解离心取上清；d)取步骤c)中上清与抗体beads进行免疫共沉淀，4℃条件下孵化过夜；e)在冰上采用磁性装置分离出beads，使mRNA从beads上分离。优选的，采用质粒pUBC-EGFP-L10A标记小鼠layerⅡ/Ⅲ神经元。优选的，质粒溶液中包括：pUBC-EGFP-L10A质粒、pCAG-tdTomato质粒和固绿染料。优选的，电转仪共刺激4～8次，刺激每次持续50ms，强度40V，每次之间间隔950ms。优选的，小鼠于冰解剖缓冲液中剖出大脑，冰组织裂解液中消化裂解。更优选的，解剖缓冲液(dissectionbuffer)(50mL)：1×HBSS5ml；2.5mMHEPES-KOH125μL，35mMglucose700μL，4mMNaCO3224μL；RNase-freewater43.901ml；临用前加入100ug/mlcycloheximide50μL。组织裂解液(Tissue-lysisbuffer)(10ml)：20mMHEPES-KOH(pH7.4)200μL，150mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种信使RNA的提取方法，其特征在于：所述提取方法将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术转染至胚胎内，待生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术，获得纯化的信使RNA。/n

【技术特征摘要】
20180611 CN 20181059339101.一种信使RNA的提取方法，其特征在于：所述提取方法将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术转染至胚胎内，待生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术，获得纯化的信使RNA。


2.根据权利要求1所述的信使RNA的提取方法，其特征在于：所述标记核糖体的质粒为pUBC-EGFP-L10a。


3.根据权利要求1所述的信使RNA的提取方法，其特征在于：小鼠子宫内胚胎电转染技术采用两个质粒进行共转染。


4.根据权利要求3所述的信使RNA的提取方法，其特征在于：共转染的质粒为pUBC-EGFP-L10a和pCAG-tdTomato质粒。


5.根据权利要求2所述的信使RNA的提取方法，其特征在于：以抗GFP抗体的磁珠吸附小鼠大脑皮层核糖体上正在翻译的mRNA，纯化后获得mRNA。


6.根据权利要求1所述的信使RNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
a)取怀孕小鼠暴露小鼠胚胎，将质粒溶液注射入暴露的小鼠胚胎脑内；
b)电极头端夹住小鼠胚胎脑部两侧，电...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：湘潭智联技术转移促进有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43