CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术属于基因编辑技术领域，具体为一种CRISPR/

CRISPR / SA slutcas9 gene editing system and its application

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用
本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种能在细胞中进行基因编辑的CRISPR/Sa-SlutCas9系统以及其相关应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)、tracrRNA(trans-activatingRNA)以及Cas9蛋白形成复合体后，识别靶位点的PAM(ProtospacerAdjacentMotif)序列，crRNA会与靶DNA序列形成互补结构，Cas9蛋白行使切割DNA的功能，使DNA发生断裂损伤。其中，tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(singleguideRNA，sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non-homologousend-joining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)。NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。除了基础科研外，CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9系统做基因治疗时，需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1367个氨基酸，加上sgRNA和启动子，无法有效的包装到AAV病毒中，限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题，几个小的Cas9被专利技术出来了，包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT)；St1Cas9(PAM序列为NNAGAW)；NmCas9(PAM序列为NNNNGATT)；Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC)；CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC)，但是这些Cas9或者PAM序列复杂(在基因组中可靶向的DNA序列少)，或者编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas9蛋白小，PAM序列简单CRISPR/Cas9系统是解决上述问题的希望所在。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术目的在于提供一种编辑活性高、Cas9蛋白小、PAM序列简单的CRISPR/Cas9新的基因编辑系统及其应用。本专利技术提供的CRISPR/Cas9基因编辑系统，为Sa-SlutCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，记为CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统(即Sa-SlutCas9蛋白，它和singleguideRNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑)；能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；Sa-SlutCas9蛋白小，为1053个氨基酸，识别的PAM序列简单(NNGRR)，所述Sa-SlutCas9蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQIDNO:2改造的sgRNA序列。本专利技术中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞。本专利技术中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。本专利技术中，所述CRISPR/Cas9系统中Sa-SlutCas9是融合蛋白，是将SaCas9的PI结构域替换为SlutCas9的PI结构域，SlutCas9为StaphylococcuslutraeCas9。Sa-SlutCas9融合蛋白和singleguideRNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑。本专利技术中，所述SlutCas9蛋白属于水獭葡萄球菌属(Staphylococcuslutrae)，所述SlutCas9蛋白的UniProt的检索号为A0A1W6BMI2。本专利技术中，所述Sa-SlutCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的Sa-SlutCas9蛋白。本专利技术中，所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。本专利技术中，所述精确定位靶向DNA序列包括Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA序列上的PAM序列。本专利技术中，所述PAM序列为NNGRR，所述靶向DNA序列为：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRR(SEQIDNO:3)。本专利技术中，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。本专利技术中，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体或与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括但不限定于基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。本专利技术中，所述单碱基转换器包括但不限定于碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、或胞嘧啶到胸腺嘧啶、或胞嘧啶到尿嘧啶、或其它碱基之间的转换。本专利技术提供的基因编辑系统编辑活性高，与之前的Cas9相比具有明显的优势。本专利技术通过基因合成、分子克隆、细胞转染、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测CRISPR/Sa-SlutCas9系统的编辑效率。本专利技术提供的CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统能够在细胞中进行基因编辑，包括通过Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA，对DNA进行编辑；最后检测编辑效率。具体步骤为：(1)合成人源化的Sa-SlutCas9基因序列；并克隆到表达载体上，得到pAAV2_Sa-SlutCas9_ITR；(2)合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒pAAV2_Sa-SlutCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点，得到pAAV2_Sa-SlutCas9-hU6-sgRNA；(3)将表达Sa-SlutCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；(4)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统为

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统为Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体，能精确定位靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述Sa-SlutCas9蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQIDNO:2改造的sgRNA序列。


2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞；所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。


3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Sa-SlutCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的Sa-SlutCas9蛋白。


4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。


5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位靶向DNA序列包括Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA序列上的PAM序列。


6.根据权利要求5所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述PAM序列为NNGRR，所述靶向DNA序列为SEQIDNO3所示。


7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA可以进行磷酸化、缩短、加长、硫化、甲基化或羟基化修饰。


8.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。


9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体或与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永明，胡子英，王大奇，王帅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31