肌醇六磷酸酶制造技术

提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。基因以至少7g/L至40g/L的水平表达肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶具有较高比活性，在低pH下保持活性，并在高温下保持活性。肌醇六磷酸酶可用于包括食品、饲料、药物和清洗剂(cleaning)的多种组合物。

【技术实现步骤摘要】
肌醇六磷酸酶本申请是中国专利申请201480014287.1的分案申请，原申请的申请日是2014年3月10日，专利技术名称是“肌醇六磷酸酶”。序列表此申请通过USPTOEFS-WEB服务器电子提交，如在MPEP§502.05中授权并提出，并且此电子申请包括电子提交的序列表；此序列表的全部内容在此通过引用并入此申请的说明书。在电子提交的ASCII(.txt)文档文件上确定序列表如下：文件名称创建日期大小SEQUENCE_LISTING_VEREN067WO_D2500_1WO2014年3月5日19.6KB专利
提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。具体而言，序列提供了具有高比活性、高热稳定性、高耐热性的肌醇六磷酸酶增加水平的表达，和肌醇六磷酸酶的各种工业用途。附图说明图1：以纯化的蛋白在肌醇六磷酸(pH5.5)上测定比活性(U/mg)。毕赤酵母表达的肌醇六磷酸酶：SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)、SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)，和假单胞菌表达的肌醇六磷酸酶：SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)。图2：在100mM的柠檬酸盐pH5.5+10％的山梨醇-10％的NaCl中肌醇六磷酸酶SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)的DSC色谱图。图3：肌醇六磷酸酶在有和没有10％的山梨醇-10％的NaCl的100mM柠檬酸盐pH5.5中的DSCTm值(℃)。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)为假单胞菌表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)和SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)为毕赤酵母表达的。图4：在4mM的肌醇六磷酸上使用Britton-Robinson“通用”缓冲液，肌醇六磷酸酶的pH曲线。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)为假单胞菌表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)为毕赤酵母表达的。图5：受到SGF+胃蛋白酶处理的肌醇六磷酸酶的SDS-PAGE。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)为假单胞菌表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2表达)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5表达)和SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7表达)为毕赤酵母表达的。图6：经过SGF处理的热稳定的肌醇六磷酸酶的活性。观察到热稳定的肌醇六磷酸酶活性最小或无损失。在加入肌醇六磷酸酶之前使用pH11的缓冲液预淬灭T0样品。图7：肌醇六磷酸酶发酵(30L)的假单胞菌(P.f.)表达水平。具体实施方式肌醇六磷酸酶是磷的单酯水解酶，其催化肌醇六磷酸(肌醇六磷酸盐)水解为磷和肌醇。根据国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)命名委员会和BairochA.的“2000年的ENZYME数据库”，NucleicAcidsRes28:304-305(2000)的介绍，肌醇六磷酸酶被分类为酶学委员会(EC)编号EC3.1.3.8，并且还被称为:1-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶；肌醇六磷酸1-磷酸酶；肌醇六磷酸3-磷酸酶；或肌醇六磷酸6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被分类为EC3.1.3.26，其也被称为:4-肌醇六磷酸酶；6-肌醇六磷酸酶(基于1L-编号系统而不是1D-编号命名)；或肌醇六磷酸6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被分类为EC3.1.3.72，其也被称为5-肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被称为组氨酸磷酸酶(HAP)；β-螺旋桨肌醇六磷酸酶；紫色酸性磷酸酶(PAP)；以及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。肌醇六磷酸酶的替代名称对本领域技术人员将是已知的。肌醇六磷酸酶是可在动物饲料颗粒中具有作为补充物功效的酶的实例。肌醇六磷酸酶使肌醇六磷酸降解为肌醇核和一个或多个游离的磷酸盐分子。肌醇六磷酸由肌醇核组成，六个磷酸盐基团共价结合至该肌醇核。肌醇六磷酸是植物材料诸如大豆种子的成分，其用于产生用于动物的饲料颗粒，诸如非反刍动物，例如家禽、肉鸡、鸟类、鸡、蛋鸡、火鸡、鸭、鹅和飞禽(fowl)；反刍动物，例如母牛、家畜、马和羊；家猪(pig)、猪(swine)、小猪、生长猪和母猪；宠物包括但不限于：猫、狗、啮齿动物和兔子；鱼包括但不限于大马哈鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物包括但不限于河虾和明虾。因为这些动物不能消化肌醇六磷酸，所以肌醇六磷酸具有许多有害的影响。它螯合二价阳离子，诸如钙和镁，并且它的磷酸盐对于被饲养的动物是生物学上不可利用的形式，导致需要用这些营养物补充动物饮食，尽管它们在原料中是丰富的。而且，因为这些营养物经过动物而未经消化，所以它们对于能够降解肌醇六磷酸的食物链更加向下的分解者是可以利用的，例如，导致与动物流出物接触的地表水中的藻类水华。非反刍动物，诸如鸡、家猪和鱼，不能够从食物中获取快速生长所需的充足的磷，由于它们不能自然地产生从食物中发现的肌醇六磷酸释放磷所必需的肌醇六磷酸酶。因为大部分的磷以肌醇六磷酸的磷酸基团(肌醇六磷酸盐)的形式存在，所以仅少量来自基于植物的食品和种子的磷被利用。因此，为了增加它们的生长，存在为动物提供磷的需要。一种方案是向动物饲料添加无机磷补充物；然而，使用无机磷补充物导致由动物排泄并进入环境的磷酸盐的量增加，这导致水源的污染。另一种方案是为动物提供肌醇六磷酸酶补充物或添加肌醇六磷酸酶至动物饲料。商业上可得到的肌醇六磷酸酶产品的实例包括但不限于：PHYZYME(Dupont、Danisco、Genencor)；QUANTUM和FINASE(ABVista、ABEnzymes)；NATUPHOS(BASF)；RONOZYME(DSM)；Biofeed肌醇六磷酸酶(NovoNordisk)；Allzyme肌醇六磷酸酶(Alltech)；OPTIPHOS(Enzyvia、Phytex、Cornell)；Rovabio(Adisseo)；PHYTOUT(USWaters)。这些肌醇六磷酸酶产品中的每个至少在生产水平、生产时间、高温稳定性、低pH稳定性、比活性和剂量要求中具有限制。因此，对于肌醇六磷酸酶存在需要，例如，在较少时间内以较高产率生产的肌醇六磷酸酶、在高温下保持更多活性的肌醇六磷酸酶、在低pH下保持更多活性的肌醇六磷酸酶或具有较高比活性的肌醇六磷酸酶，较高比活性的肌醇六磷酸酶使得使用者能够减少剂量水平并减少为动物饲料生产和提供肌醇六磷酸酶的成本。肌醇六磷酸酶是由核酸序列编码的蛋白质。核酸序列或DNA被克隆进入宿主有机体，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的、重组的或合成的肌醇六磷酸酶，其被细胞内表达在至少7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0，g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、35.0g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L或40g/L的水平。/n

【技术特征摘要】
20130516 GB 1308828.1;20130312 US 61/777,1391.分离的、重组的或合成的肌醇六磷酸酶，其被细胞内表达在至少7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0，g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、35.0g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L或40g/L的水平。


2.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述细胞内表达为在革兰氏阴性细菌中。


3.权利要求2所述的肌醇六磷酸酶，其中所述革兰氏阴性细菌为假单胞菌种类、大肠杆菌种类、雷尔氏种类或柄细菌种类。


4.权利要求3所述的肌醇六磷酸酶，其中所述假单胞菌为荧光假单胞菌。


5.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶以大约35.0g/L生产。


6.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶源自或改性自：大肠杆菌、杆菌属、哈夫尼菌属、Perniophoralycii、布丘氏菌属、柠檬酸杆菌属或黑曲霉。


7.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶选自：
(a)包含SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的序列的氨基酸；
(b)SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的变体，其中所述变体包含具有与SEQIDNO:6或SEQIDNO:8至少98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同一性的序列，并且其中所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；
(c)由包括SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核酸序列编码的氨基酸序列；和
(d)包含(a)、(b)或(c)中任一项的片段的氨基酸序列，其中所述片段具有肌醇六磷酸酶活性。


8.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶由选自下列的核酸编码：
(a)包含SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列的核酸；
(b)SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的变体，其中所述变体包含具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:7至少98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同一性的序列，并且其中所述变体编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；
(c)编码包含SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的序列的多肽的核酸；
(d)(a)、(b)或(c)的核酸片段，其中所述片段编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；和
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)的全长序列互补的核酸。


9.分离的、重组的或合成的核酸，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中所述核酸选自：
(a)包含SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列的核酸；
(b)SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的变体，其中所述变体包含具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:7至少98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、9...

【专利技术属性】
技术研发人员：X·谭，A·I·索巴克，
申请(专利权)人：巴斯夫酶有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US