一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法技术

本发明专利技术属于环境微生物领域，具体为一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，经分类鉴定为附球菌(Epicoccum sorghinum)，本发明专利技术是将铜尾矿土与无菌水混合培养，筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；重复培养六次；吸取第四、五、六次培养液，分别加入到含有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，挑取菌落数多的培养皿，在含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，筛选解磷圈明显的菌落；培养纯化结果进行摇床培养，最终筛选纯化获得耐重金属解磷菌株；本发明专利技术从污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，能够调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤，促进植被生长，提高作物对重金属污染耕地土壤磷的利用率，减少化肥的使用。

A method for the production of a highly efficient heavy metal tolerant strain of epiphorus phosphate

【技术实现步骤摘要】
一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法
本专利技术属于环境微生物领域，具体涉及一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制备方法。
技术介绍
磷是植物必需的营养元素之一，我国有74％的耕地土壤缺磷。土壤中95％以上的磷为无效形式，即为难溶性磷的化合物，植物很难直接吸收利用。施入的磷肥当季作物利用率为5％-25％，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+等金属离子结合，形成难溶性磷酸盐。因此，提高磷的利用率一直是农学家及生态学家关注的问题。影响土壤磷的利用效率的因素有很多，其中，微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大。大量的研究结果证明:土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的难溶性磷转化为可吸收利用的可溶性磷的形态，增强植物对土壤中磷元素的摄取。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，解磷真菌方面的研究相对较少，真菌中的半知菌亚门更不见有报道。金属矿山开采造成矿区大片植被和耕地被破坏，同时还产生大量矿业矿渣，严重影响土壤质地和土壤理化性质。矿山开采所产生的大量酸性矿井水和尾砂矿是造成矿区及其周围地区生态系统重金属污染的主要原因之一，成为环境中重金属污染的主要污染源。近年来，国内外关于矿区土地复垦和生态重建的研究十分活跃，其中适生优良先锋植物种类的筛选和培育是一种行之有效的方法。但是矿区复垦地除了存在重金属污染的问题外，复垦地土壤的肥力低尤其是有效磷含量低的问题，是限制矿区复垦地植被重建的重要因素。本专利技术涉及的菌种是从铜尾矿场基质中分离筛选出的一株高效解磷附球菌，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cr2+、Cu2+等重金属具有很强的抗性。目前关于高效解磷附球菌及其耐重金属方面的研究在国内还未见相关报道，尤其对于此类半知菌的研究和开发利用甚少。因此，从矿区污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长；提高作物对重金属污染耕地土壤磷的利用率，减少化肥的使用都具有重要意义。
技术实现思路
针对土壤磷素利用率低的问题，本专利技术的目的在于提供一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，包括以下步骤：(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水混合后震荡培养，离心后弃去上清液；(2)按比例向沉淀中分别加入Pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液。(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNAITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNAITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccumsorghinum)；(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。优选的，所述步骤(1)中的铜尾矿土与无菌水按照1:10的体积比混合，在30℃恒温振荡培养24h，离心后弃去上清液。优选的，所述步骤(2)中向沉淀中加入含重金属无菌培养液的体积比为：沉淀：重金属无菌培养液＝1:10，在30℃恒温培养24h。优选的，所述步骤(4)中重金属无菌混合液浓度为Cd：0.005g/L、Pb：0.5g/L、Cr：2g/L、Zn：2g/L、Cu：2g/L。优选的，所述重金属无菌混合液成分包括：10g/L葡萄糖、0.3g/LNaCl、0.005g/LCdCl、0.5g/LPbCl2、2g/LCrCl3、2g/LZnSO4、2g/LCuSO4、0.3g/LKCl、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.03g/LFeSO4·7H2O、0.03g/LMnSO4·4H2O、酵母浸粉0.5g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。优选的，所述有机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/LK2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.0204g/LMnSO4、0.03g/LFeSO4、1.0g/LCaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。优选的，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/LK2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.0204g/LMnSO4、0.03g/LFeSO4、5.0g/LCa3(PO4)2、琼脂20.0g，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。优选的，所述有机磷液体培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/LK2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.0204g/LMnSO4、0.03g/LFeSO4、1.0g/LCaCO3、卵磷脂0.5g(7g吐温80)，pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。优选的，所述无机磷培养基成分包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L(NH4)2SO4、0.3g/LNaCl、0.71g/LK2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.0204g/LMnSO4、0.03g/LFeSO4、5.0g/LCa3(PO4)2、pH＝6.5-7.5，121℃灭菌30min。本专利技术从污染地筛选耐受重金属的高效解磷附球菌优点在于：1:具有耐铜离子，镉离子，铅离子等多种离子的复合型耐重金属的解菌；2:菌种在筛选过程中相较于大多数所用的土壤悬浊液直接涂在加有重金属的平板筛选的方式，本专利技术采用的是先将土壤中所有的菌种用培养液震荡培养，离心去上清，然后多次重复加入含有多种重金属离子的混合液对菌种进行耐重金属的筛选，使土壤中所有的菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水混合后震荡培养，离心后弃去上清液；/n(2)按比例向沉淀中分别加入Pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液；/n(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次按等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；/n(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；/n(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；/n(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；/n(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；/n(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；/n(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccum sorghinum)；/n(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。/n...

【技术特征摘要】
1.一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从土壤中提取混合菌株：首先将铜尾矿土与无菌水混合后震荡培养，离心后弃去上清液；
(2)按比例向沉淀中分别加入Pb、Zn、Cu、Cd、Cr得到重金属无菌混合溶液，进行振荡培养，得到培养液；
(3)吸取步骤(2)所得的培养液，再次按等浓度梯度加入步骤(2)中的重金属无菌混合液，进行振荡培养；
(4)多次重复步骤(3)直至筛选出浓度适合菌体生长的重金属无菌混合溶液；
(5)按照步骤(4)筛选出的重金属无菌混合溶液进行菌耐重金属培养，重复培养六次；
(6)分别吸取步骤(5)中第四次、第五次和第六次培养的培养液各1ml，分别加入到含有有机磷与无机磷培养基中进行平板涂布培养，并在30℃下培养一周；
(7)从步骤(6)的培养结果中挑取菌落，选择菌落数多的培养皿，然后在步骤(6)所述的含有机磷与无机磷的培养基中进行平板划线培养，并在30℃下培养一周，筛选出解磷圈明显的菌落；
(8)分别对步骤(7)的培养纯化结果进行含有机磷与无机磷液体180r/min摇床培养，定量复筛得到解磷效果好的耐重金属解磷菌株；分别将得到的耐重金属解磷菌株在含有机磷与无机磷培养基中进行培养检验，在30℃下培养一周，最终纯化获得耐重金属解磷菌株；
(9)将步骤(8)纯化获得的耐重金属解磷菌株的18SrDNAITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAS下比对，结果表明，该菌株与附球菌属同源性很高，相似度为98.24％，结合形态特征、培养特征及18SrDNAITS序列分析，该菌株确定为附球菌(Epicoccumsorghinum)；
(10)将筛选得到的耐重金属解磷菌株进行斜面接种于冰箱中保存。


2.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的铜尾矿土与无菌水按照1:10的体积比混合，在30℃恒温振荡培养24h，离心后弃去上清液。


3.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中向沉淀中加入含重金属无菌培养液的体积比为：沉淀：重金属无菌培养液＝1:10，在30℃恒温培养24h。


4.根据权利要求1所述的一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法，其特征在于，所述步骤(4)中重金属无菌混合液浓度为Cd：0.005g/L、Pb...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈章军，李士玉，王倩倩，季涛涛，徐德聪，李玲玲，王晶晶，
申请(专利权)人：合肥师范学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34