聚乙烯醇降解酶和其制造方法技术

课题在于，提供其本体在氨基酸序列水平上已经明确的新颖的PVA降解酶，并且提供该酶的制造方法、编码该酶的DNA、包含该DNA的重组DNA和转化体，通过提供具有下述(1)至(3)的特征的聚乙烯醇降解酶、该酶的制造方法、编码该酶的DNA、包含该DNA的重组DNA和转化体来解决上述课题：(1)具有氧化聚乙烯醇、生成过氧化氢的活性。(2)具有水解β‑二酮的活性。(3)在SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。

Polyvinyl alcohol degrading enzyme and its manufacturing method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚乙烯醇降解酶和其制造方法
本专利技术涉及聚乙烯醇降解酶和其制造方法，详细而言，涉及新颖的聚乙烯醇降解酶及其制造方法、编码该酶的DNA、以及包含该DNA的重组DNA和转化体。
技术介绍
聚乙烯醇(以下简称“PVA”。)是对使乙酸乙烯酯单体聚合而得到的聚合物即聚乙酸乙烯酯进行皂化(碱水解)而得到的水溶性聚合物，粘接性、粘结性、成膜性、被膜性、表面活性优异且具有高的化学稳定性，因此作为维尼纶纤维、纤维施胶剂、纸加工剂、粘接剂、膜和聚合助剂等的原料在工业上被广泛使用。其中，在纤维施胶剂等用途中需要在使用后除去PVA，由于除去PVA时使用大量的水和试剂等，因此对成本的影响、给环境造成的负荷大。PVA是合成高分子，因此具有在自然界中不易降解的缺点。作为降解PVA的手段，已大量报道了从用于处理含PVA的工厂废液的活性污泥中分离具有PVA降解能力的微生物、并且用该微生物来降解PVA的尝试。作为具有PVA降解能力的微生物，专利文献1至5等中公开了假单胞菌、不动杆菌属、鞘脂单胞菌属(以前分类为鞘氨醇单孢菌或假单胞菌)、丛毛单胞菌属(紫色细菌、光合细菌)、微杆菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属、红球菌属、乳酪杆菌属、黄单孢菌属、奈瑟氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、气杆菌属、产碱杆菌属、农杆菌属、节杆菌属、类芽孢杆菌属、心杆菌属、链霉菌属、极地杆菌属(以前分类为类固醇杆菌(Steroidobacter))、海旋菌(Thalassospira)等细菌，另外还公开了青霉菌、地霉类、担子菌类。据报道，利用微生物进行的PVA降解一般通过氧化PVA的酶和将氧化后的PVA水解的酶的共同作用而进行(非专利文献1)。图1示意性示出PVA的酶解机制。由图1可看到，作为氧化PVA的酶，已知有PVA氧化酶(PVAOxydase，也称为“仲醇氧化酶(SecondaryAlcoholOxidase)”。)、以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的PVA脱氢酶(PVADehydrogenase，PVADH)这两种，另一方面，作为将氧化后的PVA水解的酶，已知有氧化PVA水解酶(氧化PVA脱氢酶(OxidizedPVAHydrolase、OPH)，也称为“β-二酮水解酶”。)。关于假单胞菌属微生物来源的仲醇氧化酶(PVA氧化酶)和氧化PVA水解酶，1970年代后期至1980年代前期已分别报道了酶的纯化和其性质(非专利文献2和3)、PVA氧化酶被表征为分子量约50,000的单体多肽，而氧化PVA水解酶被表征为分子量约38,000的单体多肽。进一步地，还报道了使用特定的色谱用载体高效地分离纯化PVA氧化酶和氧化PVA水解酶的方法(非专利文献4)。另外，专利文献6公开了由假单胞菌属微生物的培养液制备的“酶组合物”，并且记载了包含能够氧化PVA的酶和能够将氧化后的PVA水解的酶的该“酶组合物”可以用于在修复包含PVA的文物(日文：文化財)时去除PVA。关于以PQQ为辅酶的PVA脱氢酶，多种微生物来源的酶的氨基酸序列已经明确(专利文献7、非专利文献5)，关于氧化PVA水解酶，假单胞菌属微生物来源的酶的氨基酸序列(参照专利文献3)及其立体结构已经明确(非专利文献6)。另一方面，PVA氧化酶作为多肽而纯化到单体水平、并且阐明理化学性质的报道例子较少，而具体的氨基酸序列等则完全没有报道。因此，参与PVA降解的现有公知的酶或酶组的不明之处较多，其本体已明确到足以稳定且高效地以工业规模进行PVA降解的PVA降解酶尚属未知。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2004-000259号公报专利文献2:日本特开2005-278639号公报专利文献3:日本特开2006-042611号公报专利文献4:日本特开2006-042612号公报专利文献5:日本特开2006-180706号公报专利文献6:日本专利第5891478号公报专利文献7:日本特开平09-206079号公报非专利文献非专利文献1:Matsumura等，『Macromolecules』、32卷、7753-7761页(1999年)非专利文献2:Morita等，『Agric.Biol.Chem.』，第43卷、1225-1235页(1979年)非专利文献3:Sakai等，『Agric.Biol.Chem.』，第45卷、63-71页(1981年)非专利文献4:Sakai等，『Agric.Biol.Chem.』，第47卷、153-155页(1983年)非专利文献5:Shimao等，『Biosci.Biotechnol.Biochem.』、60卷、1056-1062页(1996年)非专利文献6:Yang等，『Chembiochem.』、15卷，1882-1886页(2014年)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于，提供其本体在氨基酸序列水平上已经明确的新颖的PVA降解酶，并且提供其制造方法、编码该酶的DNA、包含该DNA的重组DNA和转化体，从而有助于以工业规模稳定且高效地降解PVA。用于解决课题的手段为了解决上述课题，本专利技术人们对产生参与PVA降解的酶的微生物反复进行了研究，以期得到新颖的PVA降解酶。在该过程中发现，一直以来已知产生PVA氧化酶、氧化PVA水解酶的假单胞菌(Pseudomonassp.)VT1B株(NBRC110478)意外地产生一种同时具有PVA氧化活性和氧化PVA水解活性两者而可以作为杂化酶独自降解PVA的、全新的PVA降解酶。然后明确了该PVA降解酶的氨基酸序列以及诸性质并建立了其制造方法，另外建立了编码该酶的DNA以及包含该DNA的重组DNA和转化体，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供具有下述(1)至(3)的特征的新颖的PVA降解酶，并且提供该酶的制造方法、编码该酶的DNA以及包含该DNA的重组DNA和转化体，从而解决上述课题：(1)具有氧化PVA、生成过氧化氢的活性；(2)具有水解β-二酮的活性；和(3)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。专利技术的效果根据本专利技术，可以提供其本体在氨基酸序列水平以及DNA水平已经明确的新颖的PVA降解酶和其制造方法，因此得到下述优点：工业化地或以工业规模更高效、稳定地进行降解酶的产生以及PVA的降解。另外，该PVA降解酶是同时具有PVA氧化活性和氧化PVA水解活性这两者的杂化酶，无需与其它酶组合使用，可以独自高效地氧化和降解PVA，因此具有使用方便的优点。因此，本专利技术所提供的新颖的PVA降解酶不仅可以用于PVA降解，还可以有效用于含PVA制品的改性、改良等与PVA有关的广泛领域。附图说明图1是示意性示出基于PVA氧化酶和氧化PVA水解酶的共同作用的PVA降解机制的图。图2是PVA降解酶的纯化标品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3是示出PVA降解酶的纯化标品PVA-A的PVA氧化活性的最适温度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乙烯醇降解酶，具有下述(1)至(3)的特征：/n(1)具有氧化聚乙烯醇、生成过氧化氢的活性；/n(2)具有水解β-二酮的活性；和/n(3)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170302 JP 2017-0396781.一种聚乙烯醇降解酶，具有下述(1)至(3)的特征：
(1)具有氧化聚乙烯醇、生成过氧化氢的活性；
(2)具有水解β-二酮的活性；和
(3)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。


2.根据权利要求1所述的聚乙烯醇降解酶，其中，聚乙烯醇氧化活性还具有下述(4)至(7)的特征：
(4)最适温度
在pH7.0、60分钟的反应条件下为35至40℃；
(5)最适pH
在27℃、60分钟的反应条件下为pH6.5至8.0；
(6)温度稳定性
在pH7.0、保持60分钟的条件下，截至45℃时稳定；和
(7)pH稳定性
在4℃、保持24小时的条件下，在pH4.5至10.5下稳定。


3.根据权利要求1或2所述的聚乙烯醇降解酶，其中，还具有下述(8)的特征：
(8)作为N末端氨基酸序列，具有序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的聚乙烯醇降解酶，其具有序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列、或具有在保持聚乙烯醇降解酶的活性的范围内使这些氨基酸序列中缺失、添加或置换1个以上的氨基酸残基且与序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列的同源性(序列一致性)为84％以上的氨基酸序列。


5.根据权利要求1至3中任一项所述的聚乙烯醇降解酶，其为假单胞菌(P...

【专利技术属性】
技术研发人员：山中章裕，松尾直纪，森哲也，西本友之，
申请(专利权)人：株式会社林原，
类型：发明
国别省市：日本;JP