唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法技术

本发明专利技术公开了一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取‑高效液相色谱在线联用检测方法。本发明专利技术首先以原位矿化法制备羟基磷灰石功能化整体柱，再以该整体柱作为固相微萃取整体柱，结合固相微萃取‑高效液相色谱在线联用系统，建立一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取‑高效液相色谱在线联用检测方法。本发明专利技术利用整体柱表面的羟基磷灰石与分析对象所带有的P‑C‑P结构之间的特异性静电相互作用实现唑来膦酸和利塞膦酸的高效萃取富集，并消除样品基质中杂质对分析检测的干扰。本发明专利技术方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广，可实现复杂实际样品中微量唑来膦酸和利塞膦酸的高效萃取富集，并满足相关高灵敏检测要求。

On line detection of zoledronic acid and risedronic acid by solid phase microextraction and high performance liquid chromatography

【技术实现步骤摘要】
唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。
技术介绍
骨质疏松，即骨质疏松症，它是一种以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。目前，骨质疏松症已攀升至我国常见病、多发病的第七位，且发病率逐年升高，情况不容乐观。据统计，我国现有8800万人罹患骨质疏松，总患病率为12.4％；其中，65岁以上老年人患病率为50％以上，并且其骨折发生率接近三分之一。根据疾病发生的情况，临床上用来治疗骨质疏松症的药物主要有基本补充剂、抑制骨吸收药物和促骨形成药物这几大类。以唑来膦酸、利塞膦酸为代表的双磷酸盐作为一类抑制骨吸收剂因其治疗效果较好在临床上得到广泛使用。但是服用双磷酸盐类药物也会带来如呕吐、腹泻、头晕等副作用，如果长期过量服用，还会出现肾功能恶化等疾病。因此，对人体内此类药物的含量检测，对确保骨质疏松治疗效果和保证用药安全极为重要。羟基磷灰石(HAP)是天然骨组织和牙齿的主要矿物成分，是磷酸钙的结晶形式，其结构分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，由带正电荷的结晶钙离子对(C位点)和带负电荷的六个氧原子簇(P位点)组成。HAP作为生物分离纯化材料最早可追溯至1956年，其作用机理包括C位点的阴离子交换作用、P位点的阳离子交换作用以及钙离子的配位作用。由于唑来膦酸、利塞膦酸等双磷酸盐物质在化学结构上都带有两个磷酸基团连接一个碳原子(P-C-P)的结构，这类物质可以与HAP上钙离子对(即C位点)产生很强的特异性阴离子交换相互作用，这既是此类药物的药效作用机理，也为我们开发该类药物的选择性萃取富集材料提供了一种新思路。本专利技术首先以原位矿化法制备羟基磷灰石功能化整体柱；再以该整体柱作为固相微萃取整体柱，利用整体柱表面的HAP与唑来膦酸、利塞膦酸所带有的P-C-P结构之间的特异性静电相互作用实现唑来膦酸和利塞膦酸的高效萃取富集，并消除样品基质中杂质对分析检测的干扰；并结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种唑来膦酸和利塞膦酸的在线联用检测方法。目前，尚未有使用HAP功能化整体柱在线富集萃取唑来膦酸和利塞膦酸的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。本专利技术首先以原位矿化法制备羟基磷灰石功能化整体柱；再以该整体柱作为固相微萃取整体柱；得益于整体柱表面原位矿化生成的HAP颗粒上的C位点与P-C-P结构之间的特异性静电相互作用实现复杂生物样品中微量唑来膦酸和利塞膦酸的高效萃取富集与在线净化；再结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种唑来膦酸和利塞膦酸的在线联用检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1)原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱：第一步，基质整体柱的制备：用色谱纯甲醇清洗聚四氟乙烯空管半小时，然后将其置于60℃烘箱中烘干；将浓度为1g/mL尿素水溶液、质量分数为37％的甲醛溶液和0.1mol/L盐酸溶液按4：5：1的体积比混合均匀，装入预先洗净的聚四氟乙烯管中，在45-65℃水浴中反应10-120分钟制得脲醛树脂基质整体柱；第二步，聚多巴胺的涂覆：通过微量输液泵用水冲洗脲醛树脂基质整体柱1小时，除去柱内未反应的物质；同时，取5mL10mmol/LpH＝8.0的Tris-HCl溶液，加入10mg多巴胺，溶解混匀后静置5分钟配制多巴胺溶液；接着，使用微量输液泵将多巴胺溶液注满脲醛树脂基质整体柱；然后，整体柱两端不封闭静置3小时；继续重复上述操作两次，得到表面聚多巴胺涂覆的脲醛树脂整体柱；第三步，原位矿化生成羟基磷灰石：首先称取354.5mgNaCl、15.9mgNaHCO3、16.8mgKCl、16.1mgNa2HPO4、6.4mgMgCl2、12.5mgCaCl2、3.2mgNa2SO4溶于30mL去离子水制得模拟体液；使用微量输液泵将模拟体液注满表面聚多巴胺涂覆的整体柱；用垫片将整体柱两端密封，置于37℃水浴中孵育3天；然后，取出整体柱，以水为流动相，用微量输液泵冲洗1小时；继续重复上述操作两次，即得到原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱。整体柱使用前用甲醇平衡半小时即可。其中，所用的聚四氟乙烯管管长为10cm，内径为750μm。2)固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统的构建与运行：所述的固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统由一个十通阀、一个六通阀、原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱、一台液相色谱输液泵-泵A、0.5mLPEEK管定量环、一台液相色谱输液泵-泵B、0.2mLPEEK管定量环、液相色谱分析柱和检测器组成。所述的联用系统具体操作步骤如下：①首先，十通阀和六通阀都在LOAD位置；装载液通过泵A平衡原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱，流速为0.2mL/min；流动相通过泵B直接经分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5mLPEEK管定量环；②当六通阀调至INJECT位置，固相微萃取开始，0.5mLPEEK管定量环中的样品经由装载液带入原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱，经过给定的时间，六通阀调回LOAD位置；③将泵A输送的溶液由装载液换成洗脱液，流速设为0.1mL/min，利用洗脱液将原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱上富集的分析对象洗脱，并收集在0.2mLPEEK管定量环中；当洗脱完成时，十通阀调节至INJECT位置，利用流动相将收集的洗脱液送入液相色谱分析柱中进行分离，接着利用检测器进行检测。其中，所述的样品溶液和装载液组成为：按体积分数比计，甲醇/水＝70/30；所述的流动相为：按体积分数比计，甲醇/15mmol/LpH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(含5mmol/L四丁基溴化铵)＝30/70；所述的洗脱液为15mmol/LpH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液；所述的分析柱为C18液相色谱分析柱；所述的检测器为二极管阵列检测器；柱温箱温度为40℃，检测波长为220nm(唑来膦酸)和260nm(利塞膦酸)。本专利技术的显著优点在于：1)本专利技术以原位矿化法制备的HAP功能化整体柱作为固相微萃取介质，该整体柱表面HAP覆盖程度高，可提高唑来膦酸和利塞膦酸与HAP之间的作用几率，增强了二者之间的特异性相互作用，提高了整体柱的特异性萃取能力；同时也能减少实际样品中的其他杂质对分析对象富集萃取的影响，实现分析对象的高效富集萃取与高灵敏检测。2)由于原位矿化法制备的HAP功能化整体柱保留了基质整体柱的优异渗透性，因此在固相微萃取操作中可以使用较高的流速，提高了分析检测的运行效率，也有利于整体柱的清洗和再生，延长了其使用寿命，提高了方法的稳定性和重现性。附图说明图1是固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统的结构示意图。图2为以原位矿化法制备的HAP功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建固相微萃取-高效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法，其特征在于：所述的检测方法是以原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。/n

【技术特征摘要】
1.唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法，其特征在于：所述的检测方法是以原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。


2.根据权利要求1所述的唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法，其特征在于：所述的羟基磷灰石功能化整体柱是通过以尿素溶液、甲醛溶液、盐酸溶液为原料，通过酸引发一步原位脱水缩聚技术制备脲醛树脂基质整体柱；然后向基质整体柱中通入多巴胺溶液，实现聚多巴胺对基质整体柱表面的涂覆；接着往整体柱中通入模拟体液，利用聚多巴胺表面的儿茶酚氨基团对模拟体液中钙离子与磷酸根离子的沉降作用诱导生成羟基磷灰石制得。


3.根据权利要求1所述的唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法，其特征在于：所述的固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统由一个十通阀、一个六通阀、原位矿化法制备的羟基磷灰石功能化整体柱、一台液相色谱输液泵-泵A、0.5mLPEEK管定量环、一台液相色谱输液泵-泵B、0.2mLPEEK管定量环、液相色谱分析柱和检测器组成。


4.根据权利要求1所述的唑来膦酸和利塞膦酸的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法，其特征在于：所述的联用系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家斌，戴永伟，
申请(专利权)人：福州佳宸生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35