一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒包括在同一反应管数字PCR反应体系中同时检测多种Ex19Del突变和L858R突变，其中Ex19Del位点使用多条ARMS引物识别突变型，L858R位点使用TaqMan荧光探针识别野生型和突变型；进行PCR扩增后，通过荧光信号位置和强度检测Ex19Del突变型、L858R突变型和L858R野生型，并对其直接进行绝对定量。本发明专利技术的试剂盒通量高、成本低，实现了Ex19Del25位点和L858R位点合为一管检测，提高了检测通量，降低了试剂耗材成本。

A digital PCR kit for detecting EGFR gene mutation

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒
本专利技术涉及数字PCR
，具体涉及一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒。
技术介绍
在NSCLC的精准医疗实践中，监测病人体内与靶向用药相关的基因突变类型可用于评估疗效。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是靶向治疗的重要作用靶点，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。EGFR基因突变是一种体细胞突变。已知人EGFR基因突变主要位于外显子18-21；NSCLC患者其EGFR突变80％以上发生的突变为外显子l9的缺失突变(Ex19Del)及外显子21的L858R突变。其中外显子19缺失突变占约46％，而L858R突变占约42％。EGFR-TKI药物对于EGFRL858R和EGFR外显子19缺失突变的患者作用显著。肿瘤组织或细胞学标志是检测人EGFR基因突变的常用检材，但组织取材会对患者造成创伤，有时会因为患者身体原因无法取材。近几年血浆游离DNA(cfDNA)被认为是可以替代肿瘤组织用来检测人EGFR基因突变的样本，cfDNA用于肿瘤突变检测的优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中均可获取；可以实现实时监测和动态检测；克服肿瘤组织的特异性。血浆中cfDNA含量很低，且cfDNA片段很短，目前用于血浆EGFR检测的方法主要有qPCR、NGS和数字PCR。NGS实验操作繁杂，成本高，检测周期长；qPCR操作简单、快速，但灵敏度相对低；数字PCR不仅快速、便捷，而且灵敏度高，在血浆EGFR检测中具有极大优势。目前市场上的数字PCR通量较低，荧光通道较少，如果能进行EGFR基因多位点同时检测，不仅能降低了试剂和耗材成本，而且无需分配低含量的cfDNA至不同的检测体系，提高了检测灵敏度。虽然也有专利描述可以在双检测通道的基础上利用探针的浓度差异进行多位点检测，临床样本的复杂性会导致信号并非以“信号堆”的形式出现，而是以“信号带”的形式出现，从而造成各“信号带”部分重叠而导致结果难以判读。EGFR最主要的突变型是Ex19Del、L858R，占人EGFR基因突变的近90％。EGFREx19Del缺失突变型数量众多，qPCR常用的方法是针对每个突变型设计一条ARMS检测引物，ARMS法常见的问题就是非特异扩增野生型模板，由于数字PCR可将扩增信号(包括非特异扩增信号)富集于一个微液滴或微反应室中，ARMS法在数字PCR平台的非特异扩增问题更加严重。目前用数字PCR检测EGFREx19Del缺失突变常见的方法有2种：1.Ex19Del缺失突变位置相对固定，在缺失位置设计检测探针或Block阻断探针，在缺失位置外侧设计通用探针，然后再设计外围通用引物，通过缺失位置检测探针或Block阻断探针的结合与否区分野生型和突变型。这种方法只能间接判断缺失区域是否存在与野生型不一致序列，当缺失区域存在SNP或者其他类型的碱基变化时，这种方法会出现假阳性。2.针对每个缺失突变型都设计专用的缺失突变检测探针，这种方法不仅提高了成本，而且会造成检测体系中探针总浓度过高而导致荧光本底值过高，影响检测。本专利技术旨在提供一种液滴数字PCR双重检测EGFREx19Del、L858R突变的方法和试剂盒，可用高通量检测10种Ex19Del缺失突变位点(ARMS法)和L858R位点，特异性强，灵敏度高，而且可以计算各位点突变率。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒包括在同一反应管数字PCR反应体系中同时检测多种Ex19Del突变和L858R突变，其中Ex19Del位点使用多条ARMS引物识别突变型，L858R位点使用TaqMan荧光探针识别野生型和突变型；进行PCR扩增后，通过荧光信号位置和强度检测Ex19Del突变型、L858R突变型和L858R野生型，并对其直接进行绝对定量。在一种实施方式中，L858R的突变率直接使用数字PCR定量结果进行计算，即L858R的突变率为L858R突变型/(L858R突变型+L858R野生型)；而Ex19Del突变率根据L858R定量结果计算，即Ex19Del突变率为Ex19Del突变型/(L858R突变型+L858R野生型)。在一种实施方式中，检测多种Ex19Del突变使用的引物探针组合如下：引物或探针序列碱基变化上游引物SEQIDNO：1AAATTCCCGTCGCTATCAAAAC2235_2249del15上游引物SEQIDNO：2TTCCCGTCGCTATCAAGACATC2236_2250del15上游引物SEQIDNO：3CCGTCGCTATCAAGGCATCTC2237_2251del15上游引物SEQIDNO：4CGTCGCTATCAAGGTTCCG2237_2255>T上游引物SEQIDNO：5CCGTCGCTATCAAGGAACCG2239_2256del18上游引物SEQIDNO：6GTCGCTATCAAGGAATCTCCG2238_2252del15上游引物SEQIDNO：7CGTCGCTATCAAGGAATCGAA2240_2257del18上游引物SEQIDNO：8CGTCGCTATCAAGGAACCATC2239_2251>C上游引物SEQIDNO：9GTCGCTATCAAGGAACCAACAT2239_2248>C上游引物SEQIDNO：10CGTCGCTATCAAGGAAGCAAC2239_2247del9下游引物SEQIDNO：11GAGCCATGGACCCCCAC通用探针SEQIDNO：12FAM-CGATGTGAGTTTCTG-MGB。在一种实施方式中，检测多种Ex19Del突变使用的引物探针组合还包括一条跨缺失区的长封闭探针，这条长封闭探针与野生型完全互补，并覆盖了ARMS引物区域，探针3’端用磷酸基团标记，避免探针向下延伸。在一种实施方式中，所述封闭探针为SEQIDNO：13：CGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA。在一种实施方式中，L858R突变检测探针分别用两种不同荧光基团标记，Ex19Del突变检测探针使用其中一种荧光基团标记；并调整L858R突变检测探针中两种不同荧光标记探针的比例，使L858R突变型信号能与Ex19Del突变型信号区分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒包括在同一反应管数字PCR反应体系中同时检测多种Ex19Del突变和L858R突变，其中Ex19Del位点使用多条ARMS引物识别突变型，L858R位点使用TaqMan荧光探针识别野生型和突变型；进行PCR扩增后，通过荧光信号位置和强度检测Ex19Del突变型、L858R突变型和L858R野生型，并对其直接进行绝对定量。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒包括在同一反应管数字PCR反应体系中同时检测多种Ex19Del突变和L858R突变，其中Ex19Del位点使用多条ARMS引物识别突变型，L858R位点使用TaqMan荧光探针识别野生型和突变型；进行PCR扩增后，通过荧光信号位置和强度检测Ex19Del突变型、L858R突变型和L858R野生型，并对其直接进行绝对定量。


2.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，L858R的突变率直接使用数字PCR定量结果进行计算，即L858R的突变率为L858R突变型/(L858R突变型+L858R野生型)；而Ex19Del突变率根据L858R定量结果计算，即Ex19Del突变率为Ex19Del突变型/(L858R突变型+L858R野生型)。


3.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，检测多种Ex19Del突变使用的引物探针组合如下：









引物或探针
序列
碱基变化


上游引物SEQIDNO：1
AAATTCCCGTCGCTATCAAAAC
2235_2249del15


上游引物SEQIDNO：2
TTCCCGTCGCTATCAAGACATC
2236_2250del15


上游引物SEQIDNO：3
CCGTCGCTATCAAGGCATCTC
2237_2251del15


上游引物SEQIDNO：4
CGTCGCTATCAAGGTTCCG
2237_2255>T


上游引物SEQIDNO：5
CCGTCGCTATCAAGGAACCG
2239_2256del18


上游引物SEQIDNO：6
GTCGCTATCAAGGAATCTCCG
2238_2252del15


上游引物SEQIDNO：7
CGTCGCTATCAAGGAATCGAA
2240_2257del18


上游引物SEQIDNO：8
CGTCGCTATCAAGGAACCATC
2239_2251>C


上游引物SEQIDNO：9
GTCGCTATCAAGGAACCAACAT
2239_2248>C


上游引物SEQIDNO：10
CGTCGCTATCAAGGAAGCAAC
2239_2247del9


下游引物SEQIDNO：11
GAGCCATGGACCCCCAC



通用探针SEQIDNO：12
FAM-CGATGTGAGTTTCTG-MGB







。


4.根据权利要求3所述的检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，检测多种Ex19Del突变使用的引物探针组合还包括一条跨缺失区的长封闭探针，这条长封闭探针与野生型完全互补，并覆盖了ARMS引物区域，探...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭志勇，祝令香，郭永，芮孝，王栋，杨文军，高娜，
申请(专利权)人：新羿制造科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11