检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括针对先天性肾性尿崩症AVPR2基因全外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序，本发明专利技术可快速地检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变情况。

Primers, methods and kits for detecting avpr2 gene mutations in congenital renal diabetes insipidus

【技术实现步骤摘要】
检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及一种检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物和方法。
技术介绍
先天性肾性尿崩症(congenitalnephrogenicdiabetesinsipidus，CNDI)是以血浆精氨酸加压素(argininevasopressin，AVP)水平正常或升高，但肾脏不能正常浓缩尿液为特征的疾病。CNDI常在出生后的第1年发病，临床特征包括多尿、多饮、呕吐、食欲减退、便秘、发热和生长发育迟滞等。AVP是调节肾脏重吸收功能的主要激素。它由垂体后叶分泌，在低血容量或高血钠时分泌增多，通过血液循环到达肾脏，与位于集合管细胞基底外侧的AVP受体(V2R)结合。激活的V2R通过刺激Gs蛋白和腺苷酸环化酶导致细胞内cAMP水平升高，使蛋白激酶A激活、水通道蛋白(aquaporin，AQP2)磷酸化。AQP2四聚体中的三个单体磷酸化就可以使AQP2同源四聚体重新分布，使AQP2从储存囊泡转运至顶膜，增加集合管主细胞对水的通透性。间质的高渗状态促使水重吸收和尿液浓缩，以此来代偿机体的低血容量或高钠的状态。AVP与V2R分离后，上述过程可逆转。由此可见，要形成正常的尿量和尿渗透压，除了需要AVP之外，V2R和AQP2的正常表达和发挥功能也至关重要。CNDI中，AVP水平正常或升高，因此，导致疾病的分子位点主要在V2R和AQP2。研究发现，导致CNDI中V2R和AQP2功能异常的原因主要是编码它们的基因发生了突变。总体而言，90％的CNDI患者是由于AVPR2(argininevasopressinreceptortype2gene)基因突变所致的，以X-连锁隐性的方式遗传；不超过10％的CNDI患者是由于AQP2基因突变造成的，其中90％的AQP2基因突变是常染色体隐性遗传的。作为编码人类V2R的基因，AVPR2位于Xq28染色体，有3个外显子和2个内含子。AVPR2基因编码的含有371个氨基酸的多肽由7个跨膜区将4个细胞外和4个胞内区域连接而成。统计到目前为止，已在483个家系中共发现了279个导致CNDI的AVPR2基因变异，现已证实，AVPR2基因突变并非局限于受体蛋白基因的某一个区域，而是分散存在于整个基因片段的编码区。多数患者只要出现单个氨基酸的改变，就可以明显减少AVPR2受体在细胞膜上的数量或降低受体与AVP的亲和力。某些突变虽然不影响蛋白质的合成，但是显著降低了AVP受体与Gs蛋白的偶联。由于尿崩症多在婴幼儿时期发病，如果患者不能及时得到诊断和治疗，可能出现严重智力发育迟缓，甚至由于严重的高钠血症而死亡。而对于明确诊断的患者给予适当的低钠饮食配合噻嗪类药物治疗，大多数病例可以避免严重的智力障碍及脱水等严重的并发症。因此，先天性尿崩症的早期诊断尤为重要。对于NDI患者进行AVPR2基因突变的筛查是肾性尿崩症基因诊断的主要方法。而且，通过确诊先证者，还能够及时提示对发生突变患者的家系成员进行基因突变筛查，以确诊临床表现不典型的NDI患者。此外，基因检测也有助于判断CNDI患者的遗传倾向(AVPR2突变多为X-连锁遗传，而AQP2多为常染色体遗传)，从而指导优生优育。
技术实现思路
本专利技术采用Sanger测序法检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因全部外显子，并且设计的引物分别扩增包含先天性肾性尿崩症AVPR2基因全部编码区，通过测序结果的分析，可以很直观的了解先天性肾性尿崩症AVPR2基因的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物，其特征在于，包括扩增覆盖检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因全外显子的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为：AVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTGAVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；AVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACAAVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；AVPR2-E2-F：GCTCTTCATCTTCGCCCAVPR2-E2-R：GCCCAGCACAGCACATA；AVPR2-E2-3-F：GCCAAGACTGTGAGGATGAAVPR2-E2-3-R：ACACGCTGCTGCTGAAA；AVPR2-E3-F：ACCAGCCATCCTGAACCAVPR2-E3-R：CTCCACACCCACCGTTA；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，正、反向引物的使用浓度比为：1:1，序引物的使用浓度比为：M13F:M13R＝1:1。本专利技术还提供了一种检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，扩增引物序列如下：AVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTGAVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；AVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACAAVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；AVPR2-E2-F：GCTCTTCATCTTCGCCCAVPR2-E2-R：GCCCAGCACAGCACATA；AVPR2-E2-3-F：GCCAAGACTGTGAGGATGAAVPR2-E2-3-R：ACACGCTGCTGCTGAAA；AVPR2-E3-F：ACCAGCCATCCTGAACCAVPR2-E3-R：CTCCACACCCACCGTTA；(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；测序引物序列如下：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：AACAGCTATGACCATG；(4)将(3)中的基因序列与野生AVPR2基因序列进行比较，确定AVPR2基因是否发生突变。本专利技术最后提供了一种检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括五对扩增引物，测序体系反应液包括测序引物M13F与M13R，其碱基序列为：AVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTGAVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；AVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACAAVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；AVP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物，其特征在于，包括扩增覆盖检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因全外显子的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为：/nAVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTG/nAVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；/nAVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACA/nAVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；/nAVPR2-E2-F：GCTCTTCATCTTCGCCC/nAVPR2-E2-R：GCCCAGCACAGCACATA；/nAVPR2-E2-3-F：GCCAAGACTGTGAGGATGA/nAVPR2-E2-3-R：ACACGCTGCTGCTGAAA；/nAVPR2-E3-F：ACCAGCCATCCTGAACC/nAVPR2-E3-R：CTCCACACCCACCGTTA；/nM13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；/nM13R：AACAGCTATGACCATG。/n

【技术特征摘要】
1.检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的引物，其特征在于，包括扩增覆盖检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因全外显子的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为：
AVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTG
AVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；
AVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACA
AVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；
AVPR2-E2-F：GCTCTTCATCTTCGCCC
AVPR2-E2-R：GCCCAGCACAGCACATA；
AVPR2-E2-3-F：GCCAAGACTGTGAGGATGA
AVPR2-E2-3-R：ACACGCTGCTGCTGAAA；
AVPR2-E3-F：ACCAGCCATCCTGAACC
AVPR2-E3-R：CTCCACACCCACCGTTA；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，正、反向引物的使用浓度比为：1:1，序引物的使用浓度比为：M13F:M13R＝1:1。


3.一种检测先天性肾性尿崩症AVPR2基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，扩增引物序列如下：
AVPR2-E1-F：TGGAGGCTATGGCAGTG
AVPR2-E1-R：GAGGGTGAAGGAGGTCTTTAG；
AVPR2-E2-F：GGGTGTGTATCCCTCATAACA
AVPR2-E2-R：GCAATCCAGGTGACATAGG；
AVPR2-E2-F：GCTCTTCATCTTCGCCC
AVPR2-E2-R：GCCCAGCACAGCACATA；
AVPR2-E2-3-F：GCCAAGACTGTGAGGATGA
AVPR2-E2-3-R：ACACGCTGCTGCTGAAA；
AVPR2-E3-F：ACCAGCCATCCTGAACC
AV...

【专利技术属性】
技术研发人员：周桂兰，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37