人脐带间充质干细胞无血清培养基和制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液获取方法技术

本发明专利技术公开的人脐带间充质干细胞无血清培养基、制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液的获取方法，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物5‑100ng/ml，葡多酚50‑200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子‑C 1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子‑11～10ng/ml，β‑巯基乙醇50～200μM，人血白蛋白1～100μg/ml，谷胱甘肽1‑100μg/ml，碳酸氢钠1.2‑3.7g/L。利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

Serum free medium and preparation method of human umbilical cord mesenchymal stem cells and method for obtaining serum free medium of human umbilical cord mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞无血清培养基和制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液获取方法
本专利技术属于干细胞培养
，涉及人脐带间充质干细胞无血清培养基，人脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，以及人脐带间充质干细胞无血清培养液的培养方法。
技术介绍
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最早在骨髓中发现，因其具有多项分化潜能、造血支持、促进干细胞植入、免疫调节和自我复制等特点而日益受到人们的关注。骨髓间充质干细胞已经在临床上得到广泛应用，目前研究表明脐带来源的间充质干细胞也将有更大的应用潜能。HUC-MSCs(HumanUmbilicalCordmesenchymalstemcells,人脐带间充质干细胞)即脐带间充质干细胞，表达多种干细胞的特有标志，具有分化潜力大，增殖能力强，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题限制，易于工业化制备等特征。人脐带间充质干细胞不仅可以应用到临床治疗中，而且其细胞培养过程中产生的培养上清液也具有非常好的美容护肤作用。人脐带间充质干细胞调节培养液(即人脐带间充质干细胞培养上清液)含有大量的细胞生长因子和胶原蛋白等营养物质，该营养物质能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢；促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性；促进表皮细胞的生长、分化和修复，使衰老死亡的细胞得以及时补充；同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替，使肌肤回到年轻姿态。近年来，间充质干细胞的体外扩增是在补充有胎牛血清或补充有人的自体血清或基本等同相似的血清的培养基中进行。然而，牛血清、人血清或其它动物血清可能含有血液传播的病原体，牛血清还会激发抗异性生物质蛋白抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答，另外，牛血清还会显示出批次间差异，导致性能不一致。目前虽然市场上存在一些可购买的人脐带间充质干细胞培养的血清替代物，但是效果仍不甚理想，容易受到某些机械因素和化学因素的影响，致使影响干细胞的贴壁、增殖以及稳定性的维持。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种人脐带充间质干细胞无血清培养基，能够实现人脐带间充质干细胞的体外培养，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。本专利技术的第二个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，解决现有技术中人脐带间充质干细胞的贴壁生长速度、增殖缓慢以及稳定性差的问题。本专利技术的第三个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞无血清培养液的培养方法，其制得的培养液中细胞因子和胶原蛋白含量稳定。本专利技术所采用的第一个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/ml，葡多酚为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1为1～10ng/ml，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白1～100μg/ml，谷胱甘肽为1-100μg/ml，碳酸氢钠为1.2-3.7g/L。本专利技术的第一个特点还在于，基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养浓缩液的体积百分比为2～10％。基础培养基是指F12或DMEM/F12。维生素组合物是维生素B、维生素C的一种或两种任意比例组合物。本专利技术所采用的第二个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下具体步骤：步骤1：制备无血清培养上清浓缩液人脐带间充质干细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人脐带间充质干细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液；步骤2：制备生长因子浓配液将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1四款生长因子配制成浓配液，在无菌条件下分装，冻存；步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、谷胱甘肽溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液；将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的生长因子浓配液加入混合液中混合均匀，得人脐带间充质干细胞无血清培养基。本专利技术的第二个特点还在于，基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％；维生素组合物浓度为5-100ng/ml，葡多酚浓度为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子浓度为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子浓度为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-C浓度为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/ml，β-巯基乙醇浓度为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/ml，谷胱甘肽浓度为1-100μg/ml，碳酸氢钠浓度为1.2-3.7g/L。步骤1中加水至测定的总蛋白浓度为10mg/mL。步骤1中超滤浓缩至原人脐带间充质干细胞上清液体积的1/15～1/20。步骤2中浓配液中各细胞生长因子的浓度为50ug/ml。本专利技术所采用的第三个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞培养液的制备方法，利用一种人脐带间充质干细胞无血清培养基进行制备，具体包括以下步骤：步骤A、提取人脐带间充质干细胞：清理脐带、剪碎，加入基础培养基进行培养，得到原代人脐带间充质干细胞，在原代人脐带间质干细胞中加入基础培养基进行传代培养，收集P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；步骤B、扩增培养人脐带间充质干细胞：取步骤A中的种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，传代培养基采用人脐带间充质干细胞无血清培养基，传代培养条件为：温度为37℃，5％CO2；步骤C、收集人脐带间质干细胞无血清调节培养液：收集P6到P15代培养过程中的人脐带间充质干细胞培养上清，即得人脐带间充质干细胞无血清调节培养液。本专利技术的有益效果是：(1)利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素；(2)在制备人脐带间充质干细胞无血清培养基时，添加了四种重组细胞生长因子和葡多酚，四种重组生长因子的作用是维持和刺激间充质干细胞的增殖，葡多酚的作用是提高间充质干细胞增殖活性，促进细胞分裂；(3)在制备人脐带间充质干细胞无血清培养基时，添加了无血清培养上清液，同时对该上清液经过系列处理，上清液含有干细胞自身分泌的多种生长因子、胶原蛋白及营养物质，可以作为血清替代物存在；(4)人脐带间充质干细胞无血清调节培养液可以有效地应用于抗皱、祛疤、皮肤浅表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/ml，葡多酚为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1为1～10ng/ml，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白为1～100μg/ml，谷胱甘肽为1-100μg/ml，碳酸氢钠为1.2-3.7g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/ml，葡多酚为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1为1～10ng/ml，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白为1～100μg/ml，谷胱甘肽为1-100μg/ml，碳酸氢钠为1.2-3.7g/L。


2.如权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基的体积百分比为90～98％，所述无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％。


3.如权利要求1或2所述的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基采用F12培养基或DMEM/F12培养基。


4.如权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述维生素组合物是维生素B、维生素C的一种或两种任意比例组合物。


5.如权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
人脐带间充质干细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人脐带间充质干细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液；
步骤2：制备生长因子浓配液
配制重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1四款生长因子配制成浓配液，在无菌条件下分装，冻存；
步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基
将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、谷胱甘肽溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液；
将步骤1的无血清培养上清液、步骤2的生长因子浓配液加入混合液中混合均匀，得人脐带间充质干细胞无血清培养基。


6.如权利要求5所述的一种人脐...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，王海江，肖萍，胡春梅，
申请(专利权)人：西安艾尔菲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61