一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法技术

本发明专利技术提供一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法。一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法，该方法包括以下步骤：1)将芥子碱降解菌接种于脑心浸液琼脂培养基中，25～30℃条件下，培养12～96小时；2)从脑心浸液琼脂复苏培养基中挑取单个菌落接种于产酶培养基中，在25～30℃振荡培养箱中振荡培养4～6天。本发明专利技术方法培养条件简单可控，复苏和产酶效果好；可以有效刺激芥子碱降解菌的多酚氧化酶分泌量和显著提高多酚氧化酶活性，从而为进一步研究芥子碱降解菌的酶学性质和作用机理提供技术参考。

A culture method of polyphenoloxidase produced by sinapine degrading bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法
本专利技术涉及一种微生物降解，特别是涉及一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法。
技术介绍
芥子碱是菜籽粕等十字花科类植物性饲料资源中最重要的一种抗营养因子之一，其主要有以下有害作用：1)在肠道微生物的作用下，被降解为三甲胺，使动物产生鱼腥味综合征，影响动物健康，降低畜产品品质；2)味道苦涩、影响饲料适口性和动物采食量；3)能与蛋白质、微量元素等结合降低它们的消化利用率；4)具有抗雄激素作用，影响动物繁殖性能。芥子碱降解菌是指具有芥子碱降解功能的一类微生物，它们可以利用自身分泌的生物酶有效降解芥子碱。多酚氧化酶是参与芥子碱降解的主要酶类。CN105087511A公开了一种真菌发酵法制备多酚氧化酶的培养基及其制备方法，虽然该方法的目的也是制备多酚氧化酶，但其采用的是一种真菌类冠突散囊菌，其复苏培养基为马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，产酶培养基主要成分为麸皮、茶叶、蛋白胨和无机盐，生产的多酚氧化酶主要是针对茶多酚。CN104845918B公开了一种产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，该专利技术是筛选具有芥子碱降解功能的菌株，推荐的培养基组成和培养参数并不能保证多酚氧化酶具有较高活力。CN109593672A公开了一种一株假交替单胞菌属多糖降解菌及其培养方法与应用，CN109385455A公开了一种降解小麦秸秆半纤维素的黄孢原毛平革菌的应用方法。以上两件专利技术公开的虽然也属于微生物降解特定物质，但前者是以降解多糖为目标，或者是以降解半纤维素为目标。专利技术内容本专利技术所要解决的技术问题是提供一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法，该方法包括以下步骤：1)芥子碱降解菌的复苏培养芥子碱降解菌的复苏培养采用以下4种中的任意1种脑心浸液琼脂(BHI)培养基：①牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；蔗糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5。②牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5。③牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5。④牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；淀粉0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5。使用平板划线法，将分离培养并保存的芥子碱降解菌接种于上述脑心浸液琼脂(BHI)培养基中，25～30℃条件下，培养12～96小时；所述芥子碱降解菌可采用CN104845918B所公开的方法得到的芥子碱降解菌。2)芥子碱降解菌产酶培养芥子碱降解菌产酶培养基组成：NaNO3：3.0g；K2HPO4：1.0g；MgSO4·7H2O：0.5g；KCl：0.5g；FeSO4：0.01g；胰蛋白胨：10.0～15.0g；蔗糖0.5～2.0g；芥子碱：0.4～0.8g；CuSO4：0.2～1.0g；水：1000mL；调pH至7～7.5，从脑心浸液琼脂复苏培养基中挑取单个菌落接种于产酶培养基中，在25～30℃振荡培养箱中振荡培养4～6天；所述芥子碱采用纯度大于95％的芥子碱硫氰酸盐产品，其芥子碱含量大于85％。进一步的，步骤2)后还有步骤3)芥子碱降解菌酶蛋白的提取取培养4～6天后的培养液30ml，在3000r/min的条件下离心5～10分钟，彻底移除上清液，加入10mLPBS(磷酸盐缓冲液)，在高速离心机中4℃、12000r/min的条件下离心15～20分钟，收集离心后的上清液，将上清液保存于-20℃冰箱中，备用；进一步的，步骤3)后还有步骤4)多酚氧化酶活性测定将上清液在常温下解冻后，采用多酚氧化酶活性测定试剂盒测定酶活。具体操作过程和酶活计算方法按多酚氧化酶活性测定试剂盒操作说明书进行。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法培养条件简单可控，复苏和产酶效果好；可以有效刺激芥子碱降解菌的多酚氧化酶分泌量和显著提高多酚氧化酶活性，从而为进一步研究芥子碱降解菌的酶学性质和作用机理提供技术参考。附图说明图1是本专利技术的不同实施例复苏培养条件对芥子碱降解菌浓度的影响示意图。具体实施方式实施例1复苏培养基组成为：牛脑：200.0g；牛心浸出汁：250.0g；大豆蛋白胨13.0g；淀粉1.0g；NaCl：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000ml。混合均匀后，调节培养基的pH为7。芥子碱降解菌在复苏培养基中，27℃条件下复苏培养96小时，并分别在培养后第12、24、36、48、56、72、84、96小时取培养液，测定培养液中芥子碱降解菌的浓度。从上述培养96小时的脑心浸液琼脂复苏培养基中挑取单个菌落接种于产酶培养基中，在27℃振荡培养箱中振荡培养6天。产酶培养基组成为：NaNO3：3.0g；K2HPO4：1.0g；MgSO4·7H2O：0.5g；KCl：0.5g；FeSO4：0.01g；胰蛋白胨：13g；蔗糖：1g；芥子碱：0.4g；CuSO4:0.5g；水：1000mL。取培养第2、4、6天的培养液30ml，在3000r/min的条件下离心10分钟，彻底移除上清液，加入10mLPBS，在高速离心机中4℃、12000r/min的条件下离心15分钟，收集离心后的上清液。用多酚氧化酶测定试剂盒测定上清液中多酚氧化酶活性。实施例2复苏培养基组成：牛脑：250.0g；牛心浸出汁：200.0g；大豆蛋白胨15.0g；葡萄糖2.0g；NaCl：4.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000ml混合均匀，调节培养基的pH为7.5。芥子碱降解菌在复苏培养基中，25℃条件下复苏培养96小时。分别在培养后第12、24、36、48、56、72、84、96小时取培养液，测定培养液中芥子碱降解菌的浓度。从上述培养96小时的脑心浸液琼脂复苏培养基中挑取单个菌落接种于产酶培养基中，在27℃振荡培养箱中振荡培养6天。产酶培养基组成为：NaNO3：3.0g；K2HPO4：1.0g；MgSO4·7H2O：0.5g；KCl：0.5g；FeSO4：0.01g；胰蛋白胨：13g；蔗糖：1g；芥子碱：0.6g；CuSO4:0.5g；水：1000mL。取培养第2、4、6天的培养液30ml，在30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：/n1)芥子碱降解菌的复苏培养/n芥子碱降解菌的复苏培养采用以下4种中的任意1种脑心浸液琼脂培养基：/n①牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；蔗糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；/n②牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；/n③牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；/n④牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；淀粉0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；/n将芥子碱降解菌接种于上述脑心浸液琼脂培养基中，25～30℃条件下，培养12～96小时；/n2)芥子碱降解菌产酶培养/n芥子碱降解菌产酶培养基组成：NaNO...

【技术特征摘要】
1.一种芥子碱降解菌产多酚氧化酶的培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)芥子碱降解菌的复苏培养
芥子碱降解菌的复苏培养采用以下4种中的任意1种脑心浸液琼脂培养基：
①牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；蔗糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；
②牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；胰蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；
③牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；葡萄糖0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；
④牛脑：200.0～250.0g；牛心浸出汁：200.0～250.0g；大豆蛋白胨10.0～15.0g；淀粉0.5～2.0g；NaCl：2.0～7.0g；琼脂：10.0～30.0g；蒸馏水：1000ml，调整培养基的pH为7.0～7.5；
将芥子碱降解菌接种于上述脑心浸液琼脂培养基中，25～30℃条件下，培养12～96小时；
2)芥子碱降解菌产酶培养
芥子碱降解菌产酶培养基组成：Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：余丹，黄小丽，邹成义，李斌，屈东，邓卉，汪林书，刘进远，陈瑾，杨加豹，
申请(专利权)人：四川省畜牧科学研究院，
类型：发明
国别省市：四川;51