一种重组蛋白肽图分析方法技术

本发明专利技术公开了一种重组蛋白肽图分析方法，包括如下步骤：S1、样品配制：包括S101、取重组蛋白对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml；S102、胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/mL，分装于EP管中，50μL/管，‑20℃储存备用；S103、100mmol/L NH

A peptide map analysis method of recombinant protein

The invention discloses a method for analyzing peptide diagram of recombinant protein, which comprises the following steps: S1. Sample preparation: including S101. Take the recombinant protein reference and the sample to be tested, dissolve or dilute the ultrapure water to make the final concentration 1mg / ml; S102. Trypsin solution: weigh 5mg of trypsin, dissolve the ultrapure water to make the concentration 1mg / ml, sub pack it in EP tube, 50 \u03bc L / tube, store at \u2011 20 \u2103 for standby; S1 03\u3001100mmol/L NH

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白肽图分析方法
本专利技术属于肽图分析
，具体为一种重组蛋白肽图分析方法。
技术介绍
肽图分析(PeptideMapping)是蛋白多肽药物质量控制的重要手段之一，是根据蛋白的分子量大小以及氨基酸组成特点，利用酶裂解法或化学裂解法，将蛋白质大分子裂解成较小片段，并通过一定的分离检测手段形成特征性图谱的过程。它对于蛋白质类药物结构研究和特性鉴别具有重要意义，已成为蛋白多肽类药物质量标准控制的常规指标之一。对于重组蛋白质药物的肽图检查，2015年版《中国药典》三部采用的方法一般为Trypsin裂解-反相高效液相色谱法，早期本项目的肽图谱分析直接按照药典的方法进行，虽然单次实验样品与对照品肽图谱具有较好的一致性，但其肽图谱部分峰分离度明显不够，而且不同时间实验得到的峰谱存在一定的差异，认为是由于此重组蛋白分子结构复杂，由多条肽链组成，且链间及链内含有多对二硫键，按中国药典直接进行胰酶裂解和常规梯度洗脱，因结构位阻效应和片段较多，很难酶解充分并得到理想的裂解峰图，为此，专利技术人综合各方面因素提出了一种重组蛋白肽图分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：为了解决
技术介绍
涉及的技术问题，提供一种重组蛋白肽图分析方法。本专利技术采用的技术方案如下：一种重组蛋白肽图分析方法，包括如下步骤：S1、样品配制：包括S101、取重组蛋白对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml；S102、胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/mL，分装于EP管中，50μL/管，-20℃储存备用；S103、100mmol/LNH4HCO3溶液，称取NH4HCO3395.3mg，超纯水溶解并定容至50ml；S104、10％TFA溶液：取TFA溶液100μl于EP管中，加入900μl超纯水，混匀，备用；S2、配制平衡色谱柱的流动相组；包括S201、配制流动相A：100％超纯水(含0.1％TFA)溶液：取洁净量筒，量取超纯水1000ml于蓝盖瓶中，加入TFA1.0ml，混匀，超声30min，备用。S202、流动相B：90％乙腈(含0.1％TFA)溶液:取洁净量筒，量取乙腈900ml，超纯水定容至1000ml，加入TFA1.0ml，混匀，超声30min，备用。S203、流动相C：100％乙腈，取适量乙腈(约500ml)，超声30min，备用；S204、流动相D：100％超纯水，取适量超纯水(约500ml)，超声30min，备用；S3、样品处理：取洁净1.5mlEP管，加入100mMNH4HCO3溶液200μl，待测样品200μl，同时做标准对照和空白对照，混合均匀后于100℃沸水浴加热30min；加热完毕后取出至4℃冰箱冷却5min，按照酶底比1:50，加入4μl胰蛋白酶溶液，混合均匀于恒温水槽37℃反应1h；然后加入20μl10％TFA溶液终止反应，混合均匀后离心处理，并取上清液150μl于液相进样瓶中，待HPLC进样分析；S4、HPLC检测，包括S401、HPLC设备开启：预先冲洗色谱柱，然后用初始洗脱流动相A平衡色谱柱20min至基线平稳，备用；S402、样品检测：按照下色谱条件首先平衡色谱柱80min，然后进样检测；S5、结果处理：将对照品及供试品图谱进行重叠比较，保存结果；S6、结果判定，空白对照在4～60min之间应无明显吸收峰，待测样品应与对照品肽图谱一致，则待检样品合格，反之不合格。作为本专利技术进一步技术方案：S3、样品处理中离心处理，采用离心机，且转速为10000rpm离心10min。作为本专利技术再进一步技术方案：所述S401中按照《Waterse2695型高效液相色谱仪标准操作规程》开启仪器并完成溶剂管理系统准备，连接所需色谱柱。作为本专利技术再进一步技术方案：所述S401中预先冲洗色谱柱，用50％超纯水-50％ACN冲洗色谱柱10min，流速为1ml/min。作为本专利技术再进一步技术方案：所述S402中色谱条件：色谱柱，Symmetry300TMC18(5μm，4.6×150mm)；柱温，30±5℃；流速，1ml/min；检测波长，214nm；进样体积，80μl；运行时间，76min。作为本专利技术再进一步技术方案：所述S5中重叠条件：90度重叠，间距为0。作为本专利技术再进一步技术方案：还包括S7、检测后处理：样品检测结束后，用下色谱洗脱方法冲洗色谱柱，然后用100％ACN冲洗HPLC四管路，确保各管路冲洗干净后，关闭仪器和电源。作为本专利技术再进一步技术方案：所述色谱柱一周内不再使用则拆下色谱柱，至于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术针对重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白，经过对变性、二硫键断裂、色谱条件等的优化，建立了一种稳定、可控的肽图谱分析方法用于rhEPO-Fc的质控。2、本专利技术重点解决了因结构位阻效应和片段较多，很难酶解充分并得到理想的裂解峰图的技术问题，提高重组蛋白质药物的肽图检查准确性。附图说明图1为本专利技术的HPLC分析重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白放大肽图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。1.仪器设备与试剂耗材1.1仪器设备高效液相色谱仪(e2695，Waters)、检验天平(BT2202S/BP221S，Sartorius)、超纯水机(Milli-QAdvantageA10，Millipore)、电热恒温水槽(DK-AAD，上海一恒科技)、微电脑电磁炉(LBC-20EH3，LUBY)、离心机(5415D，eppendorf)等。1.2试剂耗材TPCK-Trypsin蛋白酶(Sigma)、色谱级乙腈(Merck)、色谱级三氟乙酸(Merck)、色谱级甲醇(Sigma)、Milli-Q超纯水、碳酸氢铵(Sigma)、EP管(AXYGEN)、移液枪(eppendorf)、Symmetry300TMC18(5μm，4.6×150mm)色谱柱等。2.溶液配制2.1样品：取rhEPO-Fc对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml。2.2胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/mL，分装于EP管中，50μL/管，-20℃储存备用。2.3100mmol/LNH4HCO3溶液，称取NH4HCO3395.3mg，超纯水溶解并定容至50ml。2.410％TFA溶液：取TFA溶液100μl于EP管中，加入900μl超纯水，混匀，备用。2.5流动相A：100％超纯水(含0.1％TFA)溶液：取洁净量筒，量取超纯水1000ml于蓝盖瓶中，加入TFA1.0ml，混匀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白肽图分析方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、样品配制：/n包括S101、取SUBS-4对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml；S102、胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/mL，分装于EP管中，50μL/管，-20℃储存备用；S103、100mmol/L NH

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白肽图分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、样品配制：
包括S101、取SUBS-4对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml；S102、胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/mL，分装于EP管中，50μL/管，-20℃储存备用；S103、100mmol/LNH4HCO3溶液，称取NH4HCO3395.3mg，超纯水溶解并定容至50ml；S104、10％TFA溶液：取TFA溶液100μl于EP管中，加入900μl超纯水，混匀，备用；
S2、配制平衡色谱柱的流动相组；
包括S201、配制流动相A：含0.1％TFA的100％超纯水溶液：取洁净量筒，量取超纯水1000ml于蓝盖瓶中，加入TFA1.0ml，混匀，超声30min，备用；
S202、流动相B：含0.1％TFA的90％乙腈溶液:取洁净量筒，量取乙腈900ml，超纯水定容至1000ml，加入TFA1.0ml，混匀，超声30min，备用。
S203、流动相C：100％乙腈，取适量乙腈500ml，超声30min，备用；
S204、流动相D：100％超纯水，取适量超纯水500ml，超声30min，备用；
S3、样品处理：取洁净1.5mlEP管，加入100mM，NH4HCO3溶液200μl，待测样品200μl，同时做标准对照和空白对照，混合均匀后于100℃沸水浴加热30min；加热完毕后取出至4℃冰箱冷却5min，按照酶底比1:50，加入4μl胰蛋白酶溶液，混合均匀于恒温水槽37℃反应1h；然后加入20μl10％TFA溶液终止反应，混合均匀后离心处理，并取上清液150μl于液相进样瓶中，待HPLC进样分析；
S4、HPLC检测，包括S401、HPLC设备开启：预先冲洗色谱柱，然后用初始洗脱流动相A平衡色谱柱20min至基线平稳，备用；
S4...

【专利技术属性】
技术研发人员：程玉，兰万军，陈静山，尹祖群，张桂涛，林如新，
申请(专利权)人：东莞太力生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44