一种快速合成全基因序列的方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公布了一种用短DNA引物拼接目标基因全长序列的方法及其应用。本发明专利技术建立的拼接技术分为两个步骤：第一，短DNA引物通过互补区相互退火，在DNA聚合酶的作用下补齐gaps，产生带有切刻位点的双链模板；第二，通过基因两端的上下游引物，以第一步反应的产物为模板，扩增全长序列。本发明专利技术还提供了一种用python语言实现的计算机算法，用以自动设计用于合成基因全长序列的短DNA引物。利用本技术在构建多重突变体基因时，仅需找到对应位点所在的DNA引物，进行碱基替换后直接用新合成的引物替换原来的引物，经过简单的PCR扩增，即可得到无模板残留干扰的突变体基因。

A method of rapid synthesis of whole gene sequence and its application

The invention belongs to the technical field of genetic engineering, and discloses a method for splicing the full-length sequence of a target gene with short DNA primers and its application. The splicing technology established by the invention is divided into two steps: first, the short DNA primers are annealed mutually through complementary regions, and gap is supplemented under the action of DNA polymerase to produce a double chain template with cutting sites; second, the full-length sequence is amplified by the upstream and downstream primers at both ends of the gene, taking the product of the first step reaction as the template. The invention also provides a computer algorithm implemented in Python language to automatically design short DNA primers for synthesizing full-length gene sequences. In the construction of multiple mutants, we only need to find the DNA primer of the corresponding site, and directly replace the original primer with the new synthesized primer after base substitution. After simple PCR amplification, we can get the mutant gene without template residual interference.

【技术实现步骤摘要】
一种快速合成全基因序列的方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种快速合成基因全长序列的方法及其应用。
技术介绍
要获得某一基因的DNA序列，可以从宿主的基因组DNA中PCR扩增出目标片段，也可以在DNA合成公司直接合成。前者往往需要专门购买菌株，提取基因组DNA，周期较长，操作繁琐。后者往往需要较长的周期和较高的成本，而且大多数公司返回的合成产物是重组质粒，会不可避免的引入酶切位点，对于不使用任何酶切位点的无缝同源重组的克隆方法并不适合。Rouillard等(RouillardJM,LeeW,TruanG,etal.Gene2Oligo:oligonucleotidedesignforinvitrogenesynthesis[J].Nucleicacidsresearch,2004,32(suppl_2):W176-W180.)报道了一种仅仅合成单链引物，经过相互退火，连接酶连接，然后再加入特异性的上下游引物PCR扩增，得到基因全长序列。这种方法有较高的准确性，但是由于对正、负链都要全覆盖，需要合成大量的寡核苷酸引物，并且需要体外磷酸化，合成成本较高。进一步的，为了研究基因编码产物的功能，经常需要对基因进行突变，常见方法有重叠延伸PCR和同源重组，这两种方法都是基于特异性突变引物的，每个突变位点都需要一对特异性引物来引入突变。当需要多位点突变时，重叠延伸PCR和同源重组都需要多次连续的PCR，操作繁琐。而且新构造的突变体都需要上一步的基因做模板，最终得到的产物混有少量的其他突变型，对目标突变体的筛选产生干扰。陈立涵等建立了一种在目的基因内部构建多位点突变的方法，他们采用磷酸化引物进行反向PCR，产物经连接反应可以自连为环，甲基化后作为下一轮PCR的模板，PCR产物经DpnI处理去除原基因型，即得到新的突变体(陈立涵,等：一种快速构建基因多个点突变体方法的建立。生物化学与生物物理进展,2013,40(7):678-685)。该方法减少了干扰基因型，产物为重组质粒便于测序和表达，但仍需要多次PCR，不够简便。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种快速合成基因全长序列的方法，以解决上述背景中的技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种快速合成基因全长序列的方法，包括以下步骤：S1，第一步PCR，将相同浓度的若干条短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反应混合液中，进行PCR扩增，得扩增产物；S2，第二步PCR，以第一步的扩增产物为模板，在高保真DNA聚合酶反应混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通过PCR反应程序，合成全基因序列；S3，将第二步PCR的产物纯化回收，然后把回收产物与线性载体重组，转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒通过DNA测序确认合成基因的准确性。进一步的，上述短DNA引物设计方法，包括以下步骤：步骤1，设计公式(式中N代表引物数目，X代表全基因序列长度，a代表相邻引物间重叠序列的长度(a≥17)，b代表引物序列的长度(b≤59)，符号代表向上取整)，计算需要合成的短DNA引物的数目，先令b＝59，若N为偶数，b＝59，若N为奇数，将b－1，直到N为偶数，此时b的值就是引物的长度；步骤2，待合成基因5’端第一个碱基起始，截取长度为b的序列作为第一条引物，从第一条引物末尾向前移动a个碱基作为下一条引物的起始，依次类推，直到目的基因末尾；步骤3，将S2中截取的全部引物按顺序编号，当引物序号为偶数时，对其序列取反向互补，得DNA引物。进一步的，上述一种快速合成基因全长序列的方法，在S1中，第一步PCR的所述短DNA引物的最终浓度为20nM，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量为0.25-0.5U，dNTPs的浓度为0.15mM，所述PCR反应程序中，退火温度为55℃，延伸温度为68℃，循环数为5；进一步的，上述一种快速合成基因全长序列的方法，第二步PCR的每50uL反应体系中，所述模板的用量为1uL，所述高保真DNA聚合酶混合液中聚合酶的用量为0.5-1U，dNTPs的浓度为0.2mM，所述PCR反应程序中，退火温度不低于60℃，延伸温度为68℃，循环数为22。本专利技术还提供了一种设计上述短DNA引物的方法，包括以下步骤：(1)，定义一个变量“dna”，用于储存输入的基因序列的字符串，然后将字符串中的非碱基字符去除，赋值给长度变量“seq”；(2)，根据“seq”的长度和指定的重叠区长度，并先假设引物的长度为59，计算所需引物数目x，x必须为偶数，否则将引物的长度减1，直到x为偶数，然后利用字符串切分的方法将“seq”逐个切分为指定长度的短字符串，直到字符串的末尾；(3)，定义一个函数com_rev()，用于将引物按照DNA的碱基互补原则转换为反向互补序列，然后将序号为偶数的引物转换为反向互补序列，得短DNA引物。进一步的，所述指定的重叠区长度至少为17bp。本专利技术还提供了上述快速合成全基因序列的方法在DNA片段合成及DNA序列突变等方面的应用。本专利技术的有益效果为：1、节约了DNA引物的合成成本，第一步PCR中所使用的DNA引物仅在两端有很短的重叠区，退火产物为带有gaps的双链DNA，随后gaps被聚合酶补齐，不需要对目标基因正反两条链全覆盖，很大节约了DNA引物的总碱基数。2、提高了合成的准确性，本专利技术将合成步骤分为两步，第一步PCR仅需要5个PCR循环，聚合酶拥有最高的催化活性不易出错，第二步PCR使用新的反应体系和上下游引物，提高了扩增的特异性；并且两步PCR总共不超过30个循环，不涉及中间纯化步骤，相比一步法并不麻烦。3、利用本方法合成的基因序列可以直接用于重组克隆，不需要经过限制性酶消化，因此合成的基因可以不含有任何一个多余的序列，基于这一特点，可以合成多个基因片段进行无缝组装。4、本专利技术还提供了一个计算机算法，自动将基因的DNA序列转换为引物序列，省去了人工设计的麻烦，程序还提供全基因上下游引物的设计，并且用python语言实现，不需要编译、链接、安装第三方库，使用十分便利。附图说明图1为本专利技术所述技术的基本原理。短DNA引物经过短暂的退火形成带有gaps的双链，再经过延伸补齐gaps，产生双链模板；加入全长引物，经过PCR扩增即得到目标基因的全长序列。图2为RH2搭桥PCR的产物经1％琼脂糖凝胶分析的结果，图中泳道1是直接使用浓度为20uM的引物(终浓度0.4uM)PCR的结果，泳道2是浓度为1uM的引物(终浓度20nM)拼接的结果。图3为直接以Oligo_1和Oligo_18为上下游引物扩增全长序列，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，图中泳道A代表以图1泳道1中的产物为模板进行全长PCR扩增，图中泳道B代表以图1泳道2中的产物为模板进行全长PCR扩增。图4为RH2_F和RH2_R为上下游引物扩增RH2全长序列，PCR产物经1％琼脂糖凝胶分析，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，第一步PCR，将相同浓度的若干条短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反应混合液中，通过PCR反应程序，得PCR产物；/nS2，第二步PCR，以第一步的PCR产物为模板，在高保真DNA聚合酶反应混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通过PCR反应程序，合成全基因序列；/nS3，将第二步PCR的产物纯化回收，然后把回收产物与线性载体重组，转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒通过DNA测序确认合成基因的准确性。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，第一步PCR，将相同浓度的若干条短DNA引物，加入到高保真DNA聚合酶反应混合液中，通过PCR反应程序，得PCR产物；
S2，第二步PCR，以第一步的PCR产物为模板，在高保真DNA聚合酶反应混合液中，加入全基因序列的上下游引物，通过PCR反应程序，合成全基因序列；
S3，将第二步PCR的产物纯化回收，然后把回收产物与线性载体重组，转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒通过DNA测序确认合成基因的准确性。


2.根据权利要求1所述的一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，S1所述短DNA引物的设计方法，包括以下步骤：
步骤1，设计公式式中N代表引物数目，X代表全基因序列长度，a代表相邻引物间重叠序列的长度，a≥17，b代表引物序列的长度，b≤59，符号代表向上取整；计算需要合成的短DNA引物的数目，先令b＝59，若N为偶数，b＝59，若N为奇数，将b－1，直到N为偶数，此时b的值就是引物的长度；
步骤2，以待合成基因5’端第一个碱基起始，截取长度为b的序列作为第一条引物，从第一条引物末尾向前移动a个碱基作为下一条引物的起始，依次类推，直到目的基因末尾；
步骤3，将S2中截取的全部引物按顺序编号，当引物序号为偶数时，对其序列取反向互补,得短DNA引物。


3.根据权利要求1所述的一种快速合成基因全长序列的方法，其特征在于，在S1中，第一步PCR的所述短DNA引物的最终浓度为20nM，所述高保真DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芳，
申请(专利权)人：周口师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41