PGB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种PGB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用，利用PGB蛋白成功构建获得具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体。本发明专利技术通过构建含类伴侣样蛋白的pET‑PGB3表达载体、测试目标蛋白融合蛋白表达载体以及测试含目标蛋白的pET对照载体，经过不同重组体中目标蛋白诱导表达的对比测试，发现PGB具有提高目标蛋白可溶性表达效率的伴侣样蛋白新功能，从而为蛋白质表达科学研究和工业化生产提供了一项有用的工具。

The application of PGB protein in the construction of the fusion protein expression vector with the function of chaperone like protein

The invention discloses the application of PGB protein in the construction of a fusion protein expression vector with the function of chaperone like protein, and successfully constructs a fusion protein expression vector with the function of chaperone like protein by using PGB protein. Through the construction of pet \u2011 pgb3 expression vector containing chaperone like protein, test target protein fusion protein expression vector and test target protein containing pet control vector, through the comparative test of induced expression of target protein in different recombinants, it is found that PGB has a new function of improving the soluble expression efficiency of target protein, so as to provide scientific research and Industrial production provides a useful tool.

【技术实现步骤摘要】
PGB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用
本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，特别涉及蛋白质融合表达
，具体涉及一种PGB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。
技术介绍
蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。而蛋白质表达(生产)工程中，获得天然结构蛋白，是蛋白质可溶性表达的先决条件，也是保证目标蛋白生理功能的基础，更是蛋白质工业化生产过程节省成本的环节。天然蛋白质的功能取决于蛋白质的生理构象。分子生物化学科学认为，蛋白质分子的三维结构完全取决于蛋白质分子的氨基酸序列。但近30年来的大量研究资料表明，很多生物体蛋白质的折叠与装配有其它蛋白或酶的参与，尤其是高等生物的组成蛋白的天然结构的形成，其中蛋白质分子伴侣就是最重要的、也是研究得最多的一类蛋白。分子伴侣是一类进化上非常保守的蛋白质，能与结构、大小、定位和最终功能都不相同的蛋白的多肽链非特异性结合，催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运。新合成的多肽链必须先经折叠和装配后形成特定的三维结构才具有活性。在多肽链折叠过程中，往往会产生折叠异常蛋白，或因未折叠或不全折叠，导致蛋白质分子中疏水区相互吸引，形成集聚体，在基因工程蛋白质表达领域，称为包涵体(Inclusion)。包涵体是不溶性的、没有功能的“死蛋白”。在具有伴侣样作用的蛋白质分子存在下，可有效地调控其它多肽链的正确折叠，从而避免包涵体的形成。>蛋白质分子伴侣的概念是由Dr.Laskey等人在1978年首先提出的(LaskeyRA,etal.Nature275:416-420)。他们在研究非洲爪蟾核小体形成时，发现了一种酸性核蛋白(Nucleoplasmin)。实验表明它在DNA与组蛋白装配成核小体的过程中是必需的。在生理离子强度下，体外把DNA与组蛋白混合在一起，不能自我组装，形成沉淀。但如果把组蛋白与过量Nucleoplasmin蛋白混合，再加入DNA，则可形成核小体结构，而且最终形成的核小体中不包含Nucleoplasmin分子。现在认为Nucleoplasmin的作用可能是避免带负电的DNA与带正电的组蛋白之间强静电吸引而形成非特异结合的不溶聚合物。1987年，Dr.Ikemura(IkemuraH,etal.JBC.1987,5；262(16):7859-64.)发现枯草杆菌素(Subtilisin)的折叠需要前肽(Propeptide)的帮助。这类前肽常位于信号肽与成熟多肽之间，在蛋白质合成过程中与其介导的蛋白质多肽链是一前一后合成出来的，并以共价键相连接，是成熟多肽正确折叠所必需的，成熟多肽完成折叠后即通过水解作用与前肽脱离。Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣(Intramolecularchaperones)。1993年，E11is对分子伴侣做了更为确切的定义：即分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白，能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，有控制的结合和释放，促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等，并且不是组装完成的蛋白质在发挥其正常的生物功能时的组成部分。蛋白质分子伴侣的分类：目前已知帮助新生肽折叠的蛋白(也称辅助蛋白)和蛋白体组装的蛋白质分子伴侣至少有三大类：第一类，普遍意义的分子伴侣，帮助正确折叠，阻止和修正不正确折叠。第二类，具有酶活力的分子伴侣，又称折叠酶。至今有2个折叠酶：一是蛋白质二硫键异构酶(Proteindisulfideisomerase，PDI)。二是肽基脯氨酰顺反异构(Peptidylprodylcistrans-isomerase，PPI)。第三类，分子内分子伴侣，一些研究表明，许多含前导肽(Pro肽)的前体形式合成的蛋白质折叠与成熟必须要有前导肽的存在才能完成，并不完全遵守Anfinsen规则。这类前导肽称为分子内分子伴侣(IntramolecularChaperone，IMC)。如上所述，蛋白质伴侣是一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能和亚基构成。总之，以上分类研究的蛋白质分子伴侣有两个共同特点：1)天然性，自己存在；2)同源性，即伴侣和被伴侣蛋白在同一生物体内编码和表达。然而，随着基因工程与蛋白质表达组学的研究，人们似乎忽略了另一类蛋白伴侣的存在，这类蛋白伴侣或伴侣样蛋白被人工重组到基因表达载体中，形成蛋白质表达工具。对于这类尚未归类的伴侣样蛋白，此处姑且称为“类蛋白伴侣”或“蛋白伴侣样蛋白”，这类伴侣蛋白的空间位置类似“分子内伴侣”，其用在载体中的特点如下：1)人工重组在基因表达载体中，有些已经商业化销售近40年，如Pharmacia公司的pGEX系列载体和其包含的GST蛋白，NEB公司的的pMAL系列载体和其用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)。实践证明，BST和MBP均有不同程度增加融合蛋白可溶性表达和表达量的作用，而研发厂家的初衷是用做便于分离纯化的“标签”蛋白。2)天然或非天然蛋白序列，即未经突变修饰或突变修饰的氨基酸序列。严格意义上来说，均属于非天然蛋白质序列，因为或是取其部分序列，如细菌的HSP片段GroE，GST的C端添加的蛋白酶切识别位点，以及所有融合蛋白表达载体的人工添加的多克隆区(MCS)序列或“柔性接头”区(FlexibleLinker)，这些相当于末端插入突变。3)同源或异源性，在类伴侣样蛋白表达载体系统中，同源性和异源性概念包含两个方面，一是表达载体携带的类伴侣样蛋白对表达宿主的同源性和异源性，如大肠杆菌来源的GST和MBP对于表达宿主大肠杆菌而言是同源性的蛋白；而大肠杆菌表达载体上的酵母或人类来源的SUMO(小泛素样修饰蛋白)或FABP6(人类游离脂肪酸结合蛋白-6)类伴侣样蛋白对于表达宿主大肠杆菌来说，就是异源性的蛋白。在融合蛋白表达载体中，融合蛋白本身上下游的两个蛋白在绝大部分情况下都是异源性的，毕竟这些载体大多数用来表达人类蛋白，因为很大一部分真核细胞蛋白在原核细胞中表达成包涵体，需要借助上游类伴侣样蛋白辅助增加可溶性表达量和辅助分自折叠。4)融合表达或非融合表达。自然情况下存在一类分子蛋白质内部构成伴侣，在成熟肽时已经切除或保留。有些蛋白质在自体或异体表达时，呈现自折叠高可溶性，如DNA聚合酶，FABP。有些蛋白质体外变性后具有极强的自复性能力，如RNaseA,Taq酶等，这些蛋白分子内部可能存在构成行蛋白伴侣。人工构建的类伴侣样蛋白融合蛋白表达载体就类似于分子内伴侣，可诱导下游蛋白提高正确折叠效率。有些商业化表达载体采用双表达框(TwoOperons)，其中一个表达框表达某种非特异性蛋白伴侣，另一个表达框表达目标蛋白。5)高度自折叠性和对宿主无毒。高度自折本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如SEQ ID NO：1～3中任一所示的蛋白G的B结构域片段或合并序列在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.如SEQIDNO：1～3中任一所示的蛋白G的B结构域片段或合并序列在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将如SEQIDNO：4,5所示的经优化后的PGB3蛋白编码序列插入融合蛋白表达载体中作为表达框上游的类伴侣样蛋白。


3.一种融合蛋白表达载体，其特征在于，所述融合蛋白表达载体的克隆区上游包含编码如权利要求2所述的经优化后的PGB3蛋白的核酸序列，所述融合蛋白表达载体的DNA序列如SEQIDNO：24所示。


4.如权利要求3所述的融合蛋白表达载体，其特征在于，选用用于改造的商业化空载体为原始亲本载体，所述原始亲本载体包括pET系统表达载体、酵母系统表达载体、昆虫细胞系统表达载体和哺乳动物细胞系统表达载体中的任意一种。


5.如权利要求3所述的融合蛋白表达载体，其特征在于，所述经优化后的PGB3蛋白的序列上游添加有如SEQIDNO：6,7所示的转录起始适配序列；和/或，
所述经优化后的PGB3蛋白的序列上游添加有商用分离标签蛋白；和/或，
所述经优化后的PGB3蛋白的序列下游包含一段柔性接头区、蛋白酶酶切位点识别区和用于插入下游目标蛋白的多克隆区。


6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李乾，
申请(专利权)人：因之彩生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42