一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用；所述四霉素B衍生物，分子式为C

A high efficiency and low toxicity tetramycin B derivative and its preparation and Application

The invention discloses a high efficiency and low toxicity tetramycin B derivative and its preparation and application; the tetramycin B derivative has the molecular formula of C

【技术实现步骤摘要】
一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用
本研究涉及的是一种微生物天然次级代谢产物分离制备技术，具体涉及一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用。
技术介绍
临床上广谱抗菌素、免疫抑制剂及器官移植等所造成的真菌感染使得深度真菌病及其死亡率逐年上升。由于真菌病原体耐药性的迅速发展，使得临床上可用于治疗系统性真菌感染的抗真菌药物十分有限。多烯大环内酯抗生素由于其特殊的化学结构及其良好的抗真菌活性，目前被公认为最有效的抗真菌药物。虽然历经半个多世纪的临床应用，多烯大环内酯抗生素几乎很少出现抗药性，然而由于该类药物水溶性较低、易于哺乳动物细胞膜上的胆固醇发生反应，造成严重的溶血毒性，严重影响其临床应用。四霉素B是一种常用的多烯大环内酯抗生素，据相关文献报道，其对农林植物真菌性感染具有良好的防治效果。但由于其抗真菌活性相比其他抗真菌类药物较低，且溶血毒性偏高。这一药理学性质的弊端，严重限制了四霉素B的广泛应用。因此采用基因工程的手段及生物合成策略有效生成新的生物活性较高，溶血毒性更低的天然抗真菌药物迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高效低毒四霉素B衍生物及其制备和应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术涉及一种高效低毒四霉素B衍生物，分子式为C35H55NO12，化学结构式为：第二方面，本专利技术涉及一种上述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，所述方法包括如下步骤：S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；S2、在所述同框缺失突变菌株中对四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG进行失活，获得基因tetrG失活突变菌株；S3、发酵培养所述基因tetrG失活突变菌株，经发酵液萃取、菌体浸泡、MCI胶柱层析及高效液相色谱制备分离获得所述高效低毒四霉素B衍生物。作为本专利技术的一个实施方案，所述基因nysI同框缺失突变菌株为基因工程改造菌株刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinocusvar.beijingensis)SY02。作为本专利技术的一个实施方案，所述基因tetrG失活突变菌株为基因工程改造菌株刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinocusvar.beijingensis)SY04。本专利技术中，步骤S1具体包括步骤如下：S11、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；S12、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；S13、通过对步骤S12获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株。所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段ΔNys-L与ΔNys-R；且同源臂片段ΔNys-L是插入XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段ΔNys-R是插入BspTI/HindIII酶切位点之间。同源臂片段ΔNys-L的序列如SEQIDNO.5所示；同源臂片段ΔNys-R的序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术中，步骤S2具体包括如下步骤：S21、构建用于四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513；S22、将所述质粒pJQK513通过链霉菌与大肠杆菌属间接合转移失活所述基因nysI同框缺失突变菌株中P450单加氧酶基因tetrG；S23、通过对步骤S22获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活突变菌株。步骤S21中，所述四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活是通过将基因tetrG的活性位点氨基酸Cys340突变为Ala实现的。所述四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG序列如SEQIDNO.15所示。所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的EcoRI/XbaI双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段C340A-tetrG-L与C340A-tetrG-R；且同源臂片段C340A-tetrG-L是插入EcoRI/HindIII酶切位点之间，同源臂片段C340A-tetrG-R是插入HindIII/XbaI酶切位点之间。同源臂片段C340A-tetrG-L的序列如SEQIDNO.10所示；同源臂片段C340A-tetrG-R的序列如SEQIDNO.11所示。步骤S3中，所述发酵培养是将所述基因tetrG失活突变菌株的孢子悬浮液接种于TBSY种子培养基中，220rpm，30℃培养24h后以5％的比例转接至发酵培养基，继续以220rpm，30℃条件培养120h，得发酵培养液。上述制备方法，所述TSBY种子培养基配方为Oxoid胰胨豆汤粉30g、蔗糖103g、Difco酵母膏5g、加蒸馏水定容至1L，pH7.2。发酵培养基配方为玉米粉10g、可溶性淀粉20g、黄豆饼粉10g、KH2PO40.2g、NaCl3g、NH4Cl3g、CaCO34g、加蒸馏水定容至1L，并用1M氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。步骤S3中，所述酵液萃取、菌体浸泡具体为：将所得发酵培养液离心分别收集菌体及发酵上清液；用甲醇对发酵菌体进行超声处理并充分浸泡，并用等体积的乙酸乙酯对发酵上清液进行萃取，将提取液合并后在真空旋转蒸发仪上进行减压浓缩，得到粗样A。所述MCI胶柱层析分离具体为：将所述粗样A用重量比2-4倍量的甲醇少量多次进行溶解，过滤分离，然后将分离后的浓缩液上样于MCI胶柱层析，依次用体积比梯度为0∶1、2∶8、4∶6与1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集由1∶0的甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，减压浓缩，得到粗样B。所述高效液相色谱制备分离是将所述粗样B溶于少量甲醇溶液中，经过高效液相色谱制备分离，得到所述高效低毒四霉素B衍生物；所述高效液相色谱制备分离条件是以乙腈与0.1％甲酸水溶液为流动相，乙腈与0.1％甲酸水溶液的比例为4∶6，以流速为5mL/min，250mmX10mm的BDSHYPERSILC18反向半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为304nm，每次进样量为100μl，通过确定目标峰的馏分时间，从而对样品的特定馏分进行定向累加后蒸干。第三方面，本专利技术涉及一种上述高效低毒四霉素B衍生物的产生菌株，所述菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosusvar.beijingnsis)SY04，保藏编号为CGMCCNO18369。第四方面，本专利技术涉及一种上述高效低毒四霉素B衍生物在制备抗真菌药物或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效低毒四霉素B衍生物，分子式为C

【技术特征摘要】
1.一种高效低毒四霉素B衍生物，分子式为C35H55N012，化学结构式为：





2.一种如权利要求1所述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；
S2、在所述同框缺失突变菌株中对四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG进行失活，获得基因tetrG失活突变菌株；
S3、发酵培养所述基因tetrG失活突变菌株，经发酵液萃取、菌体浸泡、MCI胶柱层析及高效液相色谱制备分离获得所述高效低毒四霉素B衍生物。


3.如权利要求2所述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括步骤如下：
S21、构建用于四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活质粒pJQK513；
S22、将所述质粒pJQK513通过链霉菌与大肠杆菌属间接合转移失活所述基因nysI同框缺失突变菌株中P450单加氧酶基因tetrG；
S23、通过对步骤S22获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活突变菌株。


4.如权利要求3所述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，其特征在于，步骤S21中，所述四霉素生物合成基因簇中P450单加氧酶基因tetrG失活是通过将基因tetrG的活性位点氨基酸Cys340突变为Ala实现的。


5.如权利要求3所述的高效低毒四霉素B衍生物的制备方法，其特征在于，所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的EcoRI/XbaI双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段C340A-tetrG-L与C340A-tetrG-R；且同源臂片段C340A-tetrG...

【专利技术属性】
技术研发人员：康前进，盛勇，白林泉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31