A method for generating a genetically modified cell population using a viral or non viral vector is disclosed. Modified viruses for generating genetically modified cell populations and / or for treating cancer are also disclosed.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】T细胞治疗的病毒方法交叉引用本申请要求于2016年10月27日提交的第62/413,814号美国临时申请和2017年1月30日提交的第62/452,081号美国临时申请的权益，以上每件申请均通过引用而整体并入本文以用于所有目的。
技术介绍
尽管癌症治疗在过去50年中取得了显著进步，但仍存在许多对于化学疗法、放射疗法或生物疗法为顽固性的肿瘤类型，特别是在通过手术技术无法解决的晚期。近来，在用来体内识别肿瘤上的分子靶标的淋巴细胞遗传工程方面取得了显著进步，从而导致了引入注目的靶向肿瘤缓解病例。然而，这些成功在很大程度上局限于血液系统肿瘤，而针对实体瘤的更广泛应用受限于缺乏由特定肿瘤中的细胞表达的可鉴别分子以及缺乏可用来特异性结合肿瘤靶标以便介导肿瘤破坏的分子。一些近期进展关注对在一些情况下触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变的鉴别。例如，可使用全外显子组测序方法来鉴别这些内源性突变。TranE等人,“Cancerimmunotherapybasedonmutation-specificCD4+Tcellsinapatientwithepithelialcancer,”Science344:641-644(2014)。援引并入本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在本文中的术语与所并入的参考文献中的术语之间存在冲突的情况下，以本文中的术语为准。
技术实现思路
本文公开了一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：提供...
【技术保护点】
1.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：/n提供来自人类受试者的细胞群体；/n通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及/n将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；/n其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161027 US 62/413,814;20170130 US 62/452,0811.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的细胞群体；
通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及
将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；
其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。
2.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的细胞群体；
通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及
将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；
其中在引入所述AAV载体后约4天，如通过荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，所述细胞群体包含至少约90％的活细胞。
3.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的细胞群体；
向所述细胞群体引入包含指导多核酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，其中所述指导多核酸与所述细胞群体内多个细胞中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因特异性结合，并且所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入断裂，从而抑制所述多个细胞中的CISH蛋白质功能；以及
向所述多个细胞中引入腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因在所述断裂处整合到所述多个细胞的基因组中，从而产生遗传修饰细胞群体；
其中所述遗传修饰细胞群体中至少约10％的细胞表达所述至少一种外源转基因。
4.一种治疗人类受试者的癌症的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的基因组改变，该基因组改变导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的抑制，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。
5.一种治疗人类受试者的胃肠癌的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的基因组改变，该基因组改变导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的抑制，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。
6.一种治疗人类受试者的癌症的方法，其包括：施用治疗有效量的离体遗传修饰细胞群体，其中至少一个所述离体遗传修饰细胞包含T细胞受体(TCR)基因中的导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中TCR蛋白质功能抑制的基因组改变，以及细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的导致所述至少一个离体遗传修饰细胞中CISH蛋白质功能抑制的基因组改变，其中所述基因组改变是通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统引入的；并且其中所述至少一个离体遗传修饰细胞进一步包含编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，其中所述外源转基因通过腺相关病毒(AAV)载体被引入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中；并且其中所述施用在所述人类受试者中治疗癌症或改善癌症的至少一种症状。
7.一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该外源基因组改变抑制至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供插入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。
8.一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该外源基因组改变抑制所述遗传修饰细胞离体群体的至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供插入到所述遗传修饰细胞离体群体的至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。
9.一种遗传修饰细胞离体群体，其包含：细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中抑制至少一个遗传修饰细胞中的CISH蛋白质功能的外源基因组改变，和T细胞受体(TCR)基因中抑制至少一个遗传修饰细胞中的TCR蛋白质功能的外源基因组改变，以及腺相关病毒(AAV)载体，该AAV载体包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因，以供插入到所述至少一个遗传修饰细胞的基因组的所述CISH基因中。
10.一种用于将至少一种外源转基因引入到细胞中的系统，所述系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，以及腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在至少一个细胞的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入双链断裂，并且其中所述AAV载体在所述断裂处向所述细胞的基因组中引入至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因；其中与包含微环和所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的类似系统相比——其中所述微环向所述基因组中引入所述至少一种外源转基因，所述系统具有更高的向所述基因组中引入所述转基因的效率，并且导致更低的细胞毒性。
11.一种用于将至少一种外源转基因引入到细胞中的系统，所述系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，以及腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在至少一个细胞的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中和T细胞受体(TCR)基因中引入双链断裂，并且其中所述AAV载体在所述断裂处向所述细胞的基因组中引入至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因；其中与包含微环和所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的类似系统相比——其中所述微环向所述基因组中引入所述至少一种外源转基因，所述系统具有更高的向所述基因组中引入所述转基因的效率，并且导致更低的细胞毒性。
12.一种治疗癌症的方法，其包括：
使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统离体修饰来自人类受试者的细胞群体中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因，其中所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入双链断裂，以生成工程化细胞群体；
使用腺相关病毒基因递送系统向所述工程化细胞群体中引入癌症响应性受体，以在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体，其中所述腺相关病毒基因递送系统包含腺相关病毒(AAV)载体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体。
13.一种治疗胃肠癌的方法，其包括：
使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统离体修饰来自人类受试者的细胞群体中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因，其中所述CRISPR系统在所述CISH基因中引入双链断裂，以生成工程化细胞群体；
使用腺相关病毒基因递送系统向所述工程化细胞群体中引入癌症响应性受体，以在所述双链断裂处整合至少一种外源转基因，从而生成癌症响应性细胞群体，其中所述腺相关病毒基因递送系统包含腺相关病毒(AAV)载体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的所述癌症响应性细胞群体。
14.一种制备遗传修饰细胞的方法，其包括：
提供宿主细胞群体；
引入重组腺相关病毒(AAV)载体和包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统；
其中所述核酸酶在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂，并且所述AAV载体在所述断裂处引入外源核酸；
其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性；
其中与已经引入所述CRISPR系统和相应野生型AAV载体的可比宿主细胞群体相比，所述外源核酸以更高的效率被引入。
15.一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的TIL群体；
用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，其包含指导核糖核酸(gRNA)；其中所述gRNA包含与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列，并且所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入双链断裂；其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及
在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约4天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述双链断裂中。
16.一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的TIL群体；
用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸，其包含指导核糖核酸(gRNA)；其中所述gRNA包含与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列，并且所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入双链断裂；其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及
在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约3天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述双链断裂中。
17.一种产生遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的TIL群体；
用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统对所述TIL群体进行离体电穿孔，其中所述CRISPR系统包含核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸以及至少一种指导核糖核酸(gRNA)；其中所述至少一种gRNA包含含有与细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因互补的序列的gRNA以及含有与T细胞受体(TCR)基因互补的序列的gRNA；其中，所述核酸酶或编码所述核酸酶的多核苷酸在所述TIL群体中的至少一个TIL的所述CISH基因中引入第一双链断裂并在其所述TCR基因中引入第二双链断裂；并且，其中所述核酸酶是Cas9或者所述多核苷酸编码Cas9；以及
在采用所述CRISPR系统进行电穿孔后约1小时至约4天，将腺相关病毒(AAV)载体引入到所述TIL群体中的所述至少一个TIL中，以将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因整合到所述第一双链断裂或所述第二双链断裂中的至少一个中。
18.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的细胞群体；
使用核酸酶或编码所述核酸酶的多肽以及指导多核酸，通过在细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因中引入断裂来离体修饰所述细胞群体中的至少一个细胞；以及
将包含至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因的腺相关病毒(AAV)载体引入到所述细胞群体中的至少一个细胞中，以将所述外源转基因在所述断裂处整合到所述至少一个细胞的基因组中；
其中与使用微环载体在可比细胞中整合所述至少一种外源转基因相比，使用所述AAV载体整合所述至少一种外源转基因降低细胞毒性。
19.一种产生遗传修饰细胞群体的方法，其包括：
提供来自人类受试者的细胞群体；
向所述细胞群体中引入包含至少一种指导多核酸的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，其中所述至少一种指导多核酸包含与所述细胞群体内多个细胞中的T细胞受体(TCR)基因特异性结合的指导多核酸和与其中的细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)基因特异性结合的指导多核酸，并且所述CRISPR系统在所述TCR基因和所述CISH基因中引入断裂，从而抑制所述多个细胞中的TCR蛋白质功能和CISH蛋白质功能；以及
向所述多个细胞中引入腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体将至少一种编码T细胞受体(TCR)的外源转基因在所述断裂处整合到所述多个细胞的基因组中，从而产生遗传修饰细胞群体；
其中所述遗传修饰细胞群体中至少约10％的细胞表达所述至少一种外源转基因。
20.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用CRISPR系统向内源TCR基因中引入断裂。
21.按照权利要求1-3和18-19的任一种方法制备的遗传修饰细胞群体。
22.按照权利要求15-17的任一种方法制备的遗传修饰肿瘤浸润性淋巴细胞群体。
23.根据权利要求1-6、12-14和18-19中任一项所述的方法，或根据权利要求7-8中任一项所述的群体，或根据权利要求10-11中任一项所述的系统，其中所述细胞或所述细胞群体或所述遗传修饰细胞群体是肿瘤浸润性淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体。
24.根据权利要求15-17和23中任一项所述的方法，或根据权利要求23所述的系统，或根据权利要求23所述的群体，其中所述TIL是T细胞。
25.根据权利要求15-17和23中任一项所述的方法，或根据权利要求23所述的系统，或根据权利要求23所述的群体，其中所述TIL是B细胞。
26.根据权利要求15-17和23中任一项所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·亨利，艾瑞克·罗德兹，莫达希尔·乔杜里，布兰登·莫里亚提，博·韦伯，史蒂文·A·罗森堡，道格拉斯·C·帕尔默，尼古拉斯·P·雷思蒂福，
申请(专利权)人：因提玛生物科学公司，明尼苏达大学董事会，美利坚合众国，由健康及人类服务部部长代表，
类型：发明
国别省市：美国;US
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