一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术提供一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条的制备，所述弓形虫胶体金免疫层析试纸条设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、层板膜、检测线、质控线和吸收垫。检测时所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

A colloidal gold strip of recombinant protein of Toxoplasma gondii surface antigen GRA1 and GRA7

The invention provides a preparation of colloidal gold test strip of Toxoplasma gondii surface antigen GRA1 and GRA7 recombinant protein. The colloidal gold immunochromatography test strip of Toxoplasma gondii is provided with a carrier plate, a sample pad, a colloidal gold binding pad, a laminar film, a detection line, a quality control line and an absorption pad. The amount of sample needed in the detection is very small, no special instrument is needed, and the result is directly read by naked eye, and the detection is simple and fast, with strong specificity, high sensitivity, accuracy and reliability, low cost, and widely used.

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条
本专利技术涉及生物检疫
，具体地说，涉及一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，同时涉及一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条。
技术介绍
弓形虫病是世界范围内流行的一种人兽共患寄生虫病，在感染人或动物后可通过胎盘方式垂直传播，造成胎儿畸形，早产，神经系统发育障碍；也可经口传播，如饮用未经灭菌的奶制品，或使用未熟的肉类。弓形虫对宿主选择性不强，可寄生在多种动物的有核细胞中，并侵害多种组织器官，对人类及动物健康造成严重的威胁。为了研制一种可快速检测弓形虫的诊断试剂，需要对抗原标志物进行筛选。以往国内外学者多用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖体作为抗原，该方法虽然特异性好，但抗原纯度较低，成分复杂，价格昂贵。而在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白产量高、操作简单、费用低廉，成为众多学者研究的对象。临床中对弓形虫的检测常采用PCR、ELISA等方法，但多因操作繁琐，耗时长，费用高等缺点，不适用与基层的推广，因此，寻找一种简便、快速、灵敏度高的诊断方法势在必行。胶体金免疫层析技术（GICA）作为一种快速诊断技术已广泛应用于多种疾病的监测，包括寄生虫病的诊断。Xu等利用血吸虫可溶性虫卵蛋白作为抗原研制用于检测血清血吸虫的胶体金免疫层析试纸条，该诊断方法不仅操作简便，而且具有较好的敏感性和特异性；Srivastava等利用利士曼原虫rK39抗原和胶体金标记蛋白A建立GICA检测技术，结果显示，该方法检测的敏感性和特异性分别为97.6%和92.6%，上述研究也进一步证明了胶体金免疫层析试纸条在寄生虫病快速检测中发挥的重要作用。目前研究比较多的弓形虫的表面抗原(SAG1(P30)、SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、虫体棒状体抗原(ROP1、ROP2)、致密颗粒蛋白(GRA1、GRA7)等。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整弓形虫抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组弓形虫抗原。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。为了实现上述技术方案，本专利技术提供一种融合蛋白，一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，将GRA1和GRA7中的信号肽和C端疏水序列排除，截取可溶性表达部位的B细胞抗原表位信息，对表达这两个基因抗原表位的重组基因进行重构。本专利技术同时提供一种弓形虫诊断试纸条，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金并标记链球菌重组蛋白rSPG，以GRA1和GRA7重组蛋白作为GICA试纸条的检测线，rSPG作为质控线，研制GICA。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段；其中，所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；本专利技术同时提供一种用于免疫分析的产品，所述产品包括本专利技术所述的融合蛋白。产品以试纸条的形式存在时，可将本专利技术复合物置于检测线，用于捕获目标分子，采用金标纳米粒子等进行检测；进一步的，当复合物融合不同的功能配体时，可实现多种目标分子的同时检测。进一步的，提供一种利用上述GRA1和GRA7重组蛋白制备的弓形虫胶体金免疫层析试纸条。所述弓形虫胶体金免疫层析试纸条设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、层板膜、检测线、质控线和吸收垫；所述样品垫、胶体金结合垫、层板膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金结合垫的另一端设在层板膜的一端上，吸收垫的一端设在层板膜的另一端上，检测线、质控线依次设在层板膜上；在检测线处包被GRA1和GRA7重组蛋白，在质控线处包被选用His标记的链球菌重组蛋白（His-rSPG）。所述载体板可采用PVC板。本专利技术提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立弓形快速检测试剂，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中弓形虫的检测。检测时所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。有益效果(1)申请人分析GRA1、GRA7的蛋白结构，在GRA1内选择7个B细胞抗原表位，在GRA7内选择抗原表位集中的4个片段，将这11个片段通过两个丙氨酸结构进行串联，使得抗原表位尽量不相互影响。将重新分析的氨基酸序列反推出碱基序列并进行密码子优化，使得新重构基因符合原核表达。然后构建相应的原核表达质粒，获得了展现弓形虫多表位的新型重组蛋白。该蛋白具有His标签，实现了亲和层析的纯化，表达量高，纯化方便，且检测相关的抗体灵敏性高。由于重组蛋白是GRA1和GRA7联合的，因此可以对弓形虫不同阶段产生的抗体均可检测。（2）在本研究中，我们采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金并标记链球菌重组蛋白rSPG，以GRA1和GRA7重组蛋白作为GICA试纸条的检测线，rSPG作为质控线，研制GICA弓形虫诊断试纸条。通过对小鼠阳性阴性血清进行检测，结果显示，该试纸条可与小鼠阳性血清发生反应，但与阴性血清不反应。通过对不同猪场猪血清进行检测结果显示，GICA法猪弓形虫检出率与标准ELISA和PCR法检测结果相比具有较高的重合性，由此也进一步说明该试纸条可用于临床中弓形虫的检测。附图说明图1重组蛋白rGRA合成示意图。图2pET-32a(+)-GRA重组质粒构建图。图3重组质粒的鉴定，其中，A.菌液PCR鉴定结果，其中：M：核酸标志物；1：rGRAPCR产物；B.双酶切鉴定结果，其中：M：核酸标志物；1：rGRA，酶切产物。图4重组蛋白的纯化和鉴定，A：重组蛋白溶解性分析M：蛋白标志物；1：重组蛋白上清液；2：重组蛋白沉淀；3：纯化后重组蛋白B：Western-blot检测重组蛋白M：蛋白标志物；1重组蛋白与小鼠弓形虫阳性血清结合能力检测图5rGRA重组蛋白抗原ELISA活性鉴定结果图6胶体金免疫层析试纸条示意图，其中，1，样品；2、样品垫；3、胶体金结合垫；4、检测线；5、质控线；6层板膜；7、PVC胶板；8、吸水垫。图7弓形虫检测试剂条检测效果鉴定，其中A：1.5mg/mL的重组蛋白rGRA与小鼠阴性血清反应结果；B：0.75mg/mL的的重组蛋白rGRA与小鼠阳性血清反应结果；C：1.5mg/mL的重组蛋白rGRA与小鼠阳性血清反应结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1重组蛋白GRA1和GRA7（简写为rGRA）的构建BALB/c鼠标准弓形虫阴阳性血清为实验室保存；待检猪血清分别采自上海爱森肉食品有限公司，重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白是对弓形虫GRA1和GRA7蛋白抗原表位进行分析，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段，对大肠杆菌使用频率低的密码子进行优化，将其替换成能编码同一氨基酸的大肠杆菌偏爱的密码子，在5’端加上BamH

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白是对弓形虫GRA1和GRA7蛋白抗原表位进行分析，合并抗原表位集中区段，两个抗原表位间以GG、GS密码子相连，建立新的目的基因片段，对大肠杆菌使用频率低的密码子进行优化，将其替换成能编码同一氨基酸的大肠杆菌偏爱的密码子，在5’端加上BamH（GGATCC）酶切位点；3’端加入终止密码子TAA，最后在其前后端加入BamH（GGATCC）和Hind（AAGCTT）酶切位点，合成后的序列总长度为663bp，GC%为58.52%，如SEQIDNO.1所示。


2.一种用于免疫分析的产品，所述产品包括权利要求1所述的融合蛋白。


3.如权利要求4的产品，产品的形式为一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条，所述胶体金试纸条设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、层板膜、检测线、质控线和吸收垫；所述样品垫、胶体金结合垫、层板膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金结合垫的另一端设在层板膜的一端上，吸收垫的一端设在层板膜的另一端上，检测线、质控线依次设在层板膜上；在检测线处包被GRA1和GRA7重组蛋白，在质控线处包被选用His标记的链球菌重组蛋白（His-rSPG）。


4.如权利要求3所述的一种弓形虫表面抗原GRA1和GRA7重组蛋白胶体金试纸条的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
蛋白表达、纯化获得的重组蛋白rGRA；
硝酸纤维素膜的点样：将rGRA稀释至0.5mg/ml，用于检测线（T线）的划线，将小鼠抗His标签单克隆抗体稀释至0.5mg/ml用于质控线（C线）的划线；将NC膜贴于底板上，之后用胶体金点样系统进行划线，划线量均为1µl/cm，划线后将底板放置于37℃烘箱中烘干2小时，密封于锡箔袋，内置干燥剂，有效期为15个月；
制备胶体金：烧制及贮存胶体金的所有玻璃器皿在酸缸中浸泡24h，取出后用去离子水反复冲洗，烘干备用；将100mL去离子水和1mL1%氯金酸置于250...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱传刚，王钊哲，周志平，冒丽，刘冀，李嘉静，纪荣毅，沈元曦，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，上海杰一生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31