一种HDAC4信号通路miRNA抑制剂及其过表达方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种HDAC4信号通路miRNA抑制剂及其过表达方法和应用，miR‑1281具有作为HDAC4信号通路抑制剂的用途。本发明专利技术的miRNA以HDAC4为靶点，通过抑制HDAC4基因表达从而抑制HDAC4信号通路的活性，具有作为HDAC4信号通路抑制剂的功能。

A miRNA inhibitor of HDAC4 signaling pathway and its over expression method and Application

The invention provides an HDAC4 signal pathway miRNA inhibitor and an over expression method and application thereof. Mir-1281 has the use of being an HDAC4 signal pathway inhibitor. The miRNA of the invention takes HDAC4 as the target, inhibits the activity of HDAC4 signal pathway by inhibiting the expression of HDAC4 gene, and has the function of acting as the inhibitor of HDAC4 signal pathway.

【技术实现步骤摘要】
一种HDAC4信号通路miRNA抑制剂及其过表达方法和应用
本专利技术属于生物医学
，涉及一种HDAC4信号通路miRNA抑制剂及其过表达方法和应用。
技术介绍
组蛋白去乙酰化酶4(histonedeacetylase，HDAC4)是组蛋白去乙酰化蛋白酶家族的重要成员，对染色体结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。通常情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体解离，核小体结构松弛，从而促使各种转录因子和协同转录因子与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化是一个动态平衡过程，由组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)共同调控。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，抑制基因的转录。大量研究结果表明，HDAC4基因与细胞生长、分化和程序性死亡及血管形成密切相关，HDAC4信号通路的异常表达与心力衰竭、心肌梗死、压力负荷导致的心肌肥大、缺血预处理诱导的心肌保护、局部缺血再灌注、高血压及心绞痛等心血管疾病的发生和发展密切相关，极具潜力作为心血管疾病治疗药物的新靶点。此外，HDAC4的基因异常激活还与胃肠道疾病、炎症性疾病、白血病、前列腺、神经系统疾病和各种肿瘤(如肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌)的形成相关。开发HDAC4激酶信号通路的抑制剂已经成为研究的热点。目前研究较多的HDAC4激酶信号通路抑制剂主要包括肽和拟肽类抑制剂、天然产物类抑制剂和通过计算机药物虚拟筛选技术发现的小分子抑制剂。其中，肽和拟肽类抑制剂是以HDAC4信号通路相关分子的磷酸化产物的氨基酸残基序列为模板设计的磷酸肽，可阻断HDAC4信号通路的传递从而达到抑制效果，但此类抑制剂容易在体内代谢失活，生物利用度较低；天然产物类抑制剂主要包括萜类和黄酮类天然活性分子，但该类化合物的提取工艺复杂，流程繁琐，特异性较弱；通过计算机药物虚拟筛选技术获得的小分子抑制剂往往合成困难，生物抑制性较弱。CN106344923A公开了组蛋白去乙酰化酶-4抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用，所述抑制剂为针对HDAC4基因的siRNA，可以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，发生自噬，并导致下游转录因子上调，然而上述siRNA是外源性的，具有一定的毒性，筛选过程较繁琐，且基因的突变可能会影响siRNA的特异性。因此，现有技术还有待于改进和发展，研发出效果更好的HDAC4抑制剂。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种HDAC4信号通路miRNA抑制剂及其过表达方法和应用，所述抑制剂包括内源性hsa-miR-1281，解决了现有HDAC4信号通路抑制剂生物稳定性差、利用度低、制备工艺繁琐等问题。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种miRNA作为HDAC4信号通路抑制剂的用途。miRNA是一类长度约为22个碱基的非编码单链小分子RNA，具有转录后调节基因表达的作用。研究结果表明，miRNA表达与细胞功能密切相关。本专利技术采用血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)刺激人肺动脉平滑肌细胞，分析基因组范围内miRNA表达谱的变化，发现在检测的1098个miRNA中，有9个miRNA表达上调，5个miRNA表达下调，在表达下调的miRNA中miR-1281下调十分显著。利用Targetscan等在线工具预测，发现HDAC4是miR-1281的潜在靶基因；利用3’-UTR实验及蛋白质水平检测，证明过表达miR-1281对HDAC4具有抑制作用，HDAC4是miR-1281的靶基因；通过在人肺动脉平滑肌细胞中过表达miR-1281，可抑制PDGFBB对HDAC4信号通路的激活，人肺动脉平滑肌细胞增殖异常。本专利技术中，采用miR-1281作为靶向分子，对HDAC4信号通路具有显著的抑制作用。优选地，所述miRNA为miR-1281。优选地，所述miR-1281的核酸序列如SEQIDNO.1所示；所述SEQIDNO.1所示的核酸序列如下：5’-TCGCCTCCTCCTCTCCC-3’.第二方面，本专利技术提供了一种HDAC4信号通路抑制剂，所述抑制剂包括miRNA。优选地，所述miRNA包括miR-1281。优选地，所述miR-1281的核酸序列如SEQIDNO.1所示。第三方面，本专利技术提供了一种如第二方面所述抑制剂的过表达方法，所述方法包括脂质体转染和/或重组表达。优选地，所述脂质体转染包括将化学合成的miRNA采用脂质体包裹后，转染细胞，进行抑制剂的过表达。本专利技术中，化学合成指通过生物公司人工合成miRNA的类似物(miRNAmimic)，本专利技术的所有核酸序列均由广州瑞博生物科技有限公司合成，本领域技术人员可根据实际情况选择不同的生物公司。本专利技术中，采用Lipofectamine2000和/或Lipofectamine3000作为脂质体转染化学合成的miRNA。优选地，所述miRNA包括miR-1281。优选地，所述重组表达包括以下步骤：(1)构建表达载体；(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行表达载体的筛选；(3)将筛选后的表达载体转染宿主细胞，进行抑制剂的过表达。优选地，步骤(1)所述构建表达载体具体包括：(1’)以人基因组DNA为模板，PCR获得扩增产物；(2’)将步骤(1’)所述扩增产物插入plv4/EGFP慢病毒载体的XhoI和EcoRI酶切位点之间。优选地，步骤(1’)所述PCR的引物的核酸序列如SEQIDNO.2～3所示；所述SEQIDNO.2所示的核酸序列如下：5’-CCGCTCGAGAGCTCCGCTCCCGGCGTC-3’；所述SEQIDNO.3所示的核酸序列如下：5’-CCGGAATTCAGAACTCGCGGCTCTAGA-3’.优选地，在步骤(3)之后还包括将筛选后的表达载体包装得到慢病毒的步骤。本专利技术采用包装得到的慢病毒感染宿主细胞，筛选后可以得到稳定过表达miR-1281的细胞。作为优选技术方案，本专利技术提供了一种如第二方面所述抑制剂的过表达方法，包括以下步骤：(1)以人基因组DNA为模板，以SEQIDNO.2～3所示的核酸序列为引物，PCR获得扩增产物；(2)将步骤(1)所述扩增产物和慢病毒载体plv4/EGFP分别采用XhoI和EcoRI限制性内切酶双酶切，得到的酶切产物采用T4DNA连接酶连接为表达载体；(3)将步骤(2)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行表达载体的筛选；(4)将筛选后的表达载体转染宿主细胞，进行miR-1281抑制剂的表达(5)将筛选后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA作为HDAC4信号通路抑制剂的用途。/n

【技术特征摘要】
1.一种miRNA作为HDAC4信号通路抑制剂的用途。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA包括miR-1281；
优选地，所述miR-1281的核酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种HDAC4信号通路抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括miRNA；
优选地，所述miRNA包括miR-1281；
优选地，所述miR-1281的核酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.一种如权利要求3所述抑制剂的过表达方法，其特征在于，所述方法包括脂质体转染和/或重组表达。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂质体转染包括将化学合成的miRNA采用脂质体包裹后，转染细胞，进行抑制剂的过表达；
优选地，所述miRNA包括miR-1281。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述重组表达包括以下步骤：
(1)构建表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行表达载体的筛选；
(3)将筛选后的表达载体转染宿主细胞，进行抑制剂的过表达。


7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建表达载体具体包括：
(1’)以人基因组DNA为模板，PCR获得扩增产物；
(2’)将步骤(1’)所述扩增产物插入plv4/EGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱政江，李翔，李燕娇，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44