一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明专利技术涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。

Preparation and application of glucose dehydrogenase

The invention discloses a preparation method of glucose dehydrogenase and its application, which specifically includes the following steps: Construction of S1, glucose dehydrogenase gene, insertion of S2, glucose dehydrogenase gene, cultivation of S3, bacteria, S4, bacterial crushing and filtration treatment, preparation of S5, crude purification of glucose dehydrogenase, two-stage purification of S6 and glucose dehydrogenase. The invention relates to biotechnology Technology field. The preparation method and application of the glucose dehydrogenase can improve the purity of the glucose dehydrogenase by improving the purification method of the glucose dehydrogenase, and achieve the goal of improving the purity of the glucose dehydrogenase by the cooperation of chromatography and separation dialysis, greatly improving the purification effect and reducing it The content of impurity protein in the purified glucose dehydrogenase is very beneficial to the application of glucose dehydrogenase in other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物工程
，具体为一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用。
技术介绍
葡萄糖脱氢酶(GDH)广泛参与生物体中的葡萄糖代谢途径，特别是芽孢杆菌在芽孢形成阶段的关键酶，借助于辅酶NAD(P)+，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成葡萄糖酸内酯，辅酶NAD(P)+则被还原为NAD(P)H，自二十世纪八十年代起，研究人员就已经克隆了来源于芽孢杆菌的GDH，并在大肠杆菌中进行了高效表达，来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族，是由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，单体的分子量约为30kDa，野生型的GDH热稳定性和pH稳定性都不理想，因此，在实际应用上受到了一定的限制，鉴于此，研究人员开始对编码GDH的基因进行体外定向进化的研究，DN46在66℃的半衰期为540分钟，而F20仅为1.3分钟。GDH的三维结构研究表明，突变体通过增强疏水作用和减小离子的排斥作用显著增强了亚基与亚基之间的相互作用力，稳定了酶的三维结构，从而提高了酶的稳定性，在底物特异性方面，GDH对其天然底物β-D-葡萄糖的特异性并不高，对结构类似的木糖、半乳糖、甘露糖都有较弱的催化作用。现有的葡萄糖脱氢酶制备过程中，大多只进行单一的电泳提纯或沉淀提纯，然而，这样的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，从而给葡萄糖脱氢酶的使用带来极大的不利。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，解决了现有的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高目的的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。优选的，所述步骤S6中透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快。优选的，所述步骤S3中培养瓶的培养基内含有45-50μl/ml的氨苄青霉素。优选的，所述步骤S3中离心分离菌体的时间为8-10分钟，分离温度为2-4℃。优选的，所述步骤S4中磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为100-110MPa。优选的，所述步骤S4中离心分离的时间为10-15分钟，分离温度为2-4℃。优选的，所述步骤S5中离心分离的时间为80-100分钟，分离温度为2-4℃。优选的，所述步骤S6中葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2-5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和混合缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.2-0.5ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1-2分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。优选的，其制备的葡萄糖脱氢酶可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。(三)有益效果本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：首先选自于乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶的结构基因为原材料，先将选取的原材料置于离心分离设备中，以转速为800-900r/min，温度为26-30℃的条件下进行充分旋转分离，然后再进行突变诱导，诱导完成后加入定向酶进行葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌菌株中，S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体，S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/nS1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；/nS2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；/nS3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；/nS4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；/nS5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；/nS6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。/n...

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；
S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；
S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；
S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；
S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；
S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。


2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢渊，杨广宇，罗漫杰，王梁，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42