一种假诺卡氏菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种假诺卡氏菌在微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用，所述的假诺卡氏菌由南京老山国家森林公园的土壤中分离纯化获得原始菌株，并经紫外线、微波、硫酸二乙酯及原生质体融合技术进行复合诱变后筛选得到本发明专利技术的假诺卡氏菌HRW001。经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为假诺卡氏菌

A pseudonocardia and its application

The invention relates to the field of microbial technology, in particular to the application of pseudonocardia in microbial transformation catalyzing the hydroxylation of sterols. The pseudonocardia is isolated and purified from the soil of Nanjing Laoshan National Forest Park to obtain the original strain, which is screened after combined mutagenesis by ultraviolet, micro wave, diethyl sulfate and protoplast fusion technology Pseudonocardia hrw001. It was identified as pseudonocardia by China general microbial species preservation and management center

【技术实现步骤摘要】
一种假诺卡氏菌及其应用
本专利技术属于微生物转化
，具体涉及一种假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.HRW001，以及利用其进行微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用。
技术介绍
假诺卡氏菌科是一类进化上相近、形态各异、肽聚糖含有Meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)、全细胞水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖、不含枝菌酸的放线菌。该科的许多成员都能发酵产生重要的生物活性物质，包括抗生素、酶类、维生素等。同时，该科中极少有病原菌，是一类安全的微生物。细胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一类依赖于亚铁血红素，催化多种复杂氧化反应的多功能酶。它可以催化的底物多种多样，广泛存在于各种生物体内，包括细菌、真菌、哺乳动物以及人体。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级，其催化反应类型多达20余类，如羟化、环氧化、脱烷基化、碳-碳偶联、氧化裂解等。日本科学家Yasutake、Fujii等人研究发现假诺卡氏菌属的羟基化酶属于CYP107家族，而链霉菌属的羟基化酶属于CYP105家族。它们都属于CYP450蛋白家族成员，拥有相似的特点：都是可溶性细胞质蛋白，含有非共价键结合的血红素，在酶发挥催化功能过程中，需要电子传递链的参与，如NADPH、Fdx和Fdr等辅酶参与传递电子到CYP450酶上。类固醇(Steroids)，是一类多元环萜类化合物，具有特殊的分子结构通式，即在环戊烷多氢菲(四个环)的母核上连接三个侧链，其生理功能丰富多样，对机体的诸多代谢活动都起着至关重要的调节作用。甾醇(Sterol)是含有羟基的类固醇，同样种类丰富、功能多样。传统的以类固醇为起始原料或中间体制备甾体类药物，一般用化学合成法，存在合成和分离纯化工艺复杂、成本高、收率低等现象。近年来，由于生物转化法的高度专一性和高催化活性，逐渐引起了广泛的关注。微生物转化甾醇化合物的羟基化反应，是甾体药物合成中应用较广泛的一种反应。目前报道中，以假诺卡氏菌和链霉菌属催化转化骨化三醇和骨化二醇的技术居多，且都存在菌株转化效率低、转化周期长、转化底物单一的问题。如专利CN108048493A公开了一种微生物转化制造1，25-二羟基维生素D3的制造方法，采用诺卡氏菌nocardiasp.Fpsw2013097对1α-羟基维生素D3进行25位羟基转化，最高收率54％；专利CN103898004A公开了一种假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法，介绍了一种工业化发酵转化骨化二醇的方法。因此，亟待筛选到一株高转化活性菌株，同时优化转化体系，并寻找多种可微生物转化的甾醇底物，进一步挖掘微生物转化的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.HRW001，以及利用其进行微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用。本专利技术的第一目的是提供一种自主筛选的具有高转化活性的假诺卡氏菌HRW001；本专利技术的第二目的是提供利用该假诺卡氏菌微生物转化甾醇类底物羟基化的方法；本专利技术的第三目的是提供可利用该假诺卡氏菌微生物转化羟基化的甾醇底物种类。实现上述专利技术目的的技术方案是：本专利技术提供一种假诺卡氏菌HRW001，分类命名为Pseudonocardiasp.HRW001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17524。所述的假诺卡氏菌由南京老山国家森林公园腐败的枯木落叶中分离后，经紫外线、微波、硫酸二乙酯及原生质体进行复合诱变后筛选得到本专利技术的菌株HRW001。菌株HRW001的显微特征为：基内菌丝和气生菌丝丰茂，形成Z字形断裂，均产生孢子链。气生菌丝产生的孢子杆状，基内菌丝产生的孢子椭圆、大小不一。菌株HRW001在不同培养基中的培养形态如下表1：表1菌株HRW001的生理生化特性如下表2：表2经16srRNA基因序列测序比对，本专利技术菌株HRW001为新菌株，分类命名为假诺卡氏菌(Pseudonocardiasp.HRW001)，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17524。本专利技术还提供一种利用上述假诺卡氏菌HRW001微生物转化甾醇类底物羟基化的方法，具体是将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化。进一步地，本专利技术提供一种制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，包括如下步骤：(1)将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为25-37℃，静置培养2-5d；(2)活化后的固体平板菌株接入一级种子培养基进行一级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-200rpm，培养周期2-4d；(3)按1-5％的接种量将一级种子液接入二级种子培养基进行二级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-400rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-3d；(4)按5-20％的接种量将二级种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养温度为25-37℃，初始pH为6.5-7.0，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0-7.5左右，转速100-300rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-5d，得到发酵液；(5)发酵液低温离心过滤后，收集菌体备用。其中，在步骤(1)、(2)、(3)、(4)中，培养基中包含碳源，该碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的至少一种。在另一实施方案中，培养基中还包含氮源，该氮源包括硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠、谷氨酸钠、氨水中的至少一种。在另一实施方案中，培养基中还包括微量元素，该微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、L-天冬酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B12中的至少一种。在另一实施方案中，培养基中还包括无机盐，该无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种。优选的，上述培养基组分比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.1-0.5％、酵母粉0.05-0.1％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％、琼脂粉1-2％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖0.5-1％、酵母粉0.1-0.3％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1-2％、酵母粉0.1-0.3％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖1-4％、酵母粉0.05-0.1％、蛋白胨1-4％、L-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假诺卡氏菌HRW001，其特征在于：分类命名为

【技术特征摘要】
1.一种假诺卡氏菌HRW001，其特征在于：分类命名为Pseudonocardiasp.HRW001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17524。


2.利用权利要求1所述的假诺卡氏菌HRW001微生物转化甾醇类底物羟基化的方法，其特征在于，将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化。


3.一种制备权利要求2所述假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为25-37℃，静置培养2-5d；
（2）活化后的固体平板菌株接入一级种子培养基进行一级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-200rpm，培养周期2-4d；
（3）按1-5%的接种量将一级种子液接入二级种子培养基进行二级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-400rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-3d；
（4）按5-20%的接种量将二级种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养温度为25-37℃，初始pH为6.5-7.0，发酵20h后流加20%氨水控制pH在7.0-7.5左右，转速100-300rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-5d，得到发酵液；
（5）发酵液低温离心过滤后，收集菌体备用。


4.根据权利要求3所述制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于：在步骤（1）、（2）、（3）、（4）中，培养基中包含碳源，该碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的至少一种；培养基中还包含氮源，该氮源包括硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠、谷氨酸钠、氨水中的至少一种；培养基中还包括微量元素，该微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、L-天冬酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B12中的至少一种；培养基中还包括无机盐，该无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种。

【专利技术属性】
技术研发人员：文昌，王辉，焦雪茜，郑慧娟，
申请(专利权)人：南京海融医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32