热带芽孢杆菌WZZ018及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热带芽孢杆菌WZZ018及其应用，所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下进行拆分；本发明专利技术提供的产酶微生物菌株‑‑热带芽孢杆菌WZZ018的区域选择性强，制备的产物对映体过量值最高可达93.72％，反应转化率高，酶反应条件温和、副产物少，环境污染小，是一种高效制备高纯度对映体的方法，适合工业化生产。

Bacillus tropicalis wzz018 and its application

The invention discloses a Bacillus tropicalis wzz018 and its application. The application of the invention is as follows: Taking Bacillus tropicalis wzz018 as the catalyst, the wet bacteria or freeze-dried bacteria powder obtained by fermentation and culture, racemizing 5 \u2011 chloro \u2011 2,3 \u2011 dihydro \u2011 2 \u2011 hydroxy \u2011 1 \u2011 oxy \u2011 1H \u2011 indene \u2011 2 \u2011 carboxylic acid methyl ester as the substrate, taking the buffer solution with pH value of 5.0-10.0 as the reaction medium, and taking 20.0-10.0 as the reaction medium It can be separated under the conditions of ~ 45 \u2103 and 100-300r / min; the enzyme producing microorganism strain provided by the invention \u2011 tropical Bacillus wzz018 has strong regional selectivity, and the maximum enantiomeric excess value of the prepared product can reach 93.72%, the reaction conversion rate is high, the enzyme reaction conditions are mild, the by-products are few, and the environmental pollution is small. It is a high-efficiency method for preparing high-purity enantiomers, which is suitable for industrial production \u3002

【技术实现步骤摘要】
热带芽孢杆菌WZZ018及其应用(一)
本专利技术涉及一种新菌株--热带芽孢杆菌WZZ0018及其在立体选择性拆分5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯反应生成光学纯S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。(二)
技术介绍
茚虫威(Indoxacard)，又名Avatar(安打)、Ammate(全垒打)、AvauntSteward，是美国杜邦公司在1992年开发的新型氨基甲酸酯类杀虫剂，通过阻断昆虫神经细胞内的钠离子通道，使神经细胞失去功能，具有触杀胃毒作用，可用在果树、蔬菜和林木等农作物上，能够有效消灭鳞翅目害虫如棉铃虫、叶蛾等，同时对半翅目和蜱类也很有效，具有用量低、杀虫谱广、使用安全以及对人畜和天敌无伤害等特点，可克服和延缓害虫抗药性的产生，它还可以与甲维盐、哒嗪硫磷制成复配杀虫剂，其增效作用明显。茚虫威具有作用机理独特、高效广谱，是替代高毒、高残留及高抗性杀虫剂的理想药剂，市场及应用前景广阔，已在美国、澳大利亚、中国等国作为“降低风险产品”(reduced-riskproduct)登记注册。茚虫威的结构是一个复杂的噁二嗪化合物，含有的手性中心仅有一个，有R和S两种异构体，但研究表明仅S-异构体有活性，R-异构体没有活性。S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯是制备茚虫威的关键手性中间体，该对映体过量值的高低直接影响最终产品的质量和杀虫剂活性，因此探索其合成工艺具有长远的应用意义，为新型杀虫剂在农业生产中的进一步应用提供理论和实践基础。迄今为止，合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的方法仅限化学法，由于原料和合成工艺的不同，获得的产品的光学纯度有很大的差异，目前，化学法制备获得的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的纯度为90％左右。根据反应原料的不同，分为以下几种不同的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的化学制备方法。(1)郭立湘以丙烯酸为原料，通过氢化、酰氯化和烷基化等一系列反应制得5-氯-2,3-二氢-1-茚酮，然后与碳酸二甲酯(DMC)和甲醇钠(NaH)缩合制得5-氯-1-氧代-2,3-二氢茚-2-羧酸甲酯，以辛可宁手性为催化剂，不对称羟基化合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚2-羧酸甲酯，其e.e值为89.4％，反应式如下：(2)胡新根等以5-氯-2-甲氧羰基-1-茚酮(Ⅰ)为起始原料探讨了不同溶剂、氧化剂、催化剂等对反应收率和产品e.e值的影响，最优反应条件：n(Ⅰ)∶n(辛可宁)∶n(过氧化氢异丙苯)＝1∶0.2∶1.2，CH2Cl2作溶剂，室温反应5h后，制得光学纯度为92％的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯，反应式如下：目前化学合成法虽然能够实现快速合成，但由于化学拆分法中存在着复杂的消旋竞争因素，很难得到光学纯度较高的单一对映异构体。其中，不对称羟基化反应步骤不仅需要大量的手性催化剂，而且要求在有机溶剂中催化过氧化物与5-氯-2,3-二氢-1-氧-1-茚酮-羧酸甲酯进行非对称性反应，化学反应剧烈，安全性差，对环境容易造成有机污染，不利于大规模工业生成。本专利技术的微生物酶法拆分制备光学纯度高的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯，反应条件温和，污染少，符合环境可持续发展的要求。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产酯水解酶微生物，提供了一种廉价高效的产酶微生物，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为反应底物，立体选择性水解制备光学纯S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术从土壤中筛选到对底物外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯具有高立体选择性的一株新菌株--热带芽孢杆菌(Bacillustropicus)WZZ018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2019241，保藏日期2019年04月08日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术还提供一种所述热带芽孢杆菌WZZ018在不对称水解外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用，具体所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下反应完全(优选20-40h)后，获得含S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的转化液，将转化液分离纯化，获得S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM(优选5-50mM，最优选20mM)，冻干菌粉加入量以缓冲液体积计为10-50g/L，优选50g/L。进一步，所述反应条件优选为25-30℃、180r/min反应24h。进一步，所述缓冲液优选为pH7.0的磷酸盐缓冲液。本专利技术所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将热带芽孢杆菌WZZ018接种至斜面培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得斜面菌体；斜面培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl1，琼脂粉15～20，pH7.0，溶剂为去离子水；(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，pH7.0～7.2，溶剂为去离子水；(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度1-2％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在10000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体，用0.2MpH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次，收集菌体在-40℃条件下真空冷冻干燥2天，获得冻干菌粉；发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖15，牛肉膏15，K2HPO4·3H2O6，KH2PO43，MgSO4·7H2O1.0，NaCl0.5，pH6.5，溶剂为去离子水。本专利技术所述转化液分离纯化的方法为：反应完毕后得到的转化液，12000rpm离心10min后，上层溶液用水循环泵真空旋蒸干燥，所得干燥样品用二氯甲烷溶解，硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913，200～300目)，用乙酸乙酯：石本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)WZZ018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019241，保藏日期2019年04月08日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。/n

【技术特征摘要】
1.热带芽孢杆菌(Bacillustropicus)WZZ018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2019241，保藏日期2019年04月08日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。


2.一种权利要求1所述热带芽孢杆菌WZZ018在拆分外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下反应完全后，转化液分离纯化，获得S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM，冻干菌粉加入量以缓冲液体积计为10～50g/L。


5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将热带芽孢杆菌WZZ018接种至斜面培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得斜面菌体；斜...

【专利技术属性】
技术研发人员：章银军，张宏云，郑建永，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33