用于产生和筛选隔离的肽文库的方法技术

共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：a)形成包含编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室，b)从所述多核苷酸表达多肽，以及c)使所述多肽环化。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库。用于筛选共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库的方法。向这样的文库中掺入非经典的核酸。

Methods for generating and screening isolated peptide libraries

A method for jointly isolating a cyclic polypeptide and a polynucleotide encoding the cyclic polypeptide comprises the following steps: a) forming a compartment containing a polynucleotide encoding the cyclic polypeptide, b) expressing a polypeptide from the polynucleotide, and C) cyclizing the polypeptide. Cyclic polypeptides and coding polynucleotides of the common compartment. The cyclic polypeptides and polynucleotide encoded libraries in the common compartment. A method for screening cyclic polypeptides and polynucleotide encoded libraries in the common compartment. The nonclassical nucleic acids were added to the library.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生和筛选隔离的肽文库的方法
本专利技术涉及环状肽及其编码多核苷酸的共同隔离。特别地，本专利技术涉及这样的隔离的环状肽的文库，以及从这样的文库筛选、选择和分选隔离的环状肽的方法。专利技术背景在分散于油相中的水滴中隔离单个样品是一种用于化学和生物学中的高通量测定的强有力的方法。这里，液滴相当于试管。液滴包含评估和解码文库成员的特定实验或特性所需的一切东西。利用大多数乳化技术生产的液滴的尺寸不均匀，并且在需要定量读数的实验中出现错杂性。微流体装置允许产生高度单分散的水滴，其频率高达每秒几(10)千。它们的直径通常为10-200微米，对应于0.5pL-4nL的体积。除了液滴形成之外，微流体形式还允许许多其他单元操作，如液滴分裂、融合、孵育、分析和分选。液滴微流体涉及纳升至飞升大小的水包油液滴的形成，其提供了特别适合隔离单个基因、生物体和细胞的明确界定且离散的环境。特别地，小型化提供了许多优势，包括减少样品消耗、提高分析性能、快速内容物混合和层流(流线型)流动。水滴将基因型与表型关联起来，因为它们提供的隔离模仿了自然细胞的隔离。在每个人造隔室中，单个基因通过无细胞方式转录和翻译，以产生其编码的蛋白质的多个拷贝。这种体外隔离(IVC)产生了“单克隆单元”，其非常适合高通量文库选择和新型肽基生物制剂的鉴定。由于基因型和表型之间的联系并非化学关联，而是共同隔离的，因此可以选择多种功能(酶促、调节、抑制、结合和结构)。这优于现有的展示选择策略(例如，细菌、病毒、酵母和噬菌体展示)，其中选择仅基于结合相互作用。由于结合与抑制或催化无关，因此使用这样的策略可能无意中导致选择出与酶表面紧密结合但在其活性位点之外的较差的抑制剂。涉及乳化的油包水(w/o)液滴中的体外蛋白质表达的研究通常使用绿色荧光蛋白(GFP)作为概念验证。Dittrich等人首次证明了用于无细胞蛋白质合成隔离和GFP表达的微结构化装置的实现。Courtois等人随后描述了用于含有可测量量的体外表达的GFP的液滴的存储和在线检测的集成芯片系统的实用性。然而，在一些情况下，仅分离单一模板不会产生足够的蛋白质以达到检测阈值。与单一lacZ基因一样，尽管β-半乳糖苷酶具有高的酶促活性(kcat＝187s-1，KM＝150μM)，但仍无法检测到表达。这一问题可以通过DNA与等温扩增系统的共同封装来克服。利用Φ29DNA聚合酶进行芯片上等温扩增是产生μg量的双链DNA的一种简单的方法。该预扩增步骤包括含有液滴的IVTT与封闭扩增DNA的那些的协同融合，然而在许多情况下，DNA扩增、IVTT和任何后续酶促测定所需的最佳条件是不同的；例如，成功扩增DNA所需的组分可能会抑制IVTT。同样，可能需要在不同的pH值下或在不同的缓冲组合物中运行每个过程。当使用油包水液滴时，不同生化反应彼此的相容性是一个问题。大多数生化方案是多步骤的过程：添加溶液，离心样品，除去上清液，洗涤团块等。将这样的方案转移到液滴是困难的。尽管可以利用专门的微流体装置来进行用于添加和/或稀释组分的液滴-液滴融合，但是当涉及较大的液滴数量并且需要额外的步骤(例如洗涤、缓冲液交换、添加或除去试剂)时，其实际上是具有挑战性的。此外，尽管液滴融合对液滴隔室的受控凝聚和化学及生物反应的启动至关重要，但该过程本身具有挑战性，因为例如液滴必须实现时间和空间同步以使融合发生，必须克服所利用的表面活性剂的稳定作用，并且对于活性融合需要使用专门的设备如电极，其中将液滴呈递至电场诱导它们的凝聚(电融合)。这使得液滴融合难以或不可能在连续的工作流中实施。在体外进行多步骤的隔离反应的一种可选技术是使用于微流体液滴中的胶珠。这些技术对于生化过程特别有用，如高通量筛选、定向演化和基因分型方法。例如，第PCT/GB2012/051106号PCT申请描述了以下用于筛选多种多肽将报告底物转化成可检测的报告子的活性的方法：1).将包含多核苷酸、报告底物和凝胶形成剂的组群的水性报告子溶液乳化成微液滴，其中每个多核苷酸编码这样的产物，其在所述微液滴中将报告底物转化为可检测的报告子；2).使微液滴内的凝胶形成剂凝固以产生胶珠，其包含多核苷酸和由产物产生的可检测的报告子；3).将水性微液滴脱乳化，并将珠粒重悬于水性检测溶液中；以及4).检测、测定或测量一个或多个珠粒中所述组群中的可检测的报告子。可以鉴定和/或分离来自水溶液的一个或多个珠粒，其包含可检测的报告子或缺少可检测的报告子。可以鉴定、扩增、克隆、测序或以其他方式研究来自一个或多个鉴定的珠粒的多核苷酸。可以，例如在质粒、病毒或PCR产物中分离多核苷酸或核酸，或者多核苷酸或核酸可以包含在细胞或病毒颗粒中。多核苷酸保留在胶珠内。与简单的油包水液滴相比，水包油包水(w/o/w)双乳剂提供了内部水性隔室，用于分离生物组分以及用于流式细胞术分析的水性载液。Tawfick和Griffiths先前利用w/o/w双乳剂作为微型化微反应器，用于创建定向蛋白质演化中的基因型-表型关联，以用于基于产物荧光的出现鉴定潜在的催化剂“命中”，其中随后通过流式细胞术选择显示所需活性的文库成员。然而，尽管已经开发了许多微流体系统来制造和分选液滴，但是所需的操作技能使得它们无法容易地在非专业环境中实现。因此，我们采用了如Zinchenko等人描述的两步骤单分散双乳剂液滴方法，其利用具有不同表面特征的两种独立的微流体装置，以用于单一(疏水装置表面涂层)和双乳剂液滴形成(亲水装置表面涂层)。所得的双乳剂液滴现在适用于经荧光活化细胞分选(FACS)的定量分析和分选。国际专利申请WO2000/036093A2公开了产生环状肽和以环状构象剪接肽中间体的方法。该方法利用断裂内含肽(splitintein)的反式剪接能力来催化来自前体肽的肽的环化，该前体肽具有插入在断裂内含肽的两个部分之间的靶肽。断裂内含肽的两个部分的相互作用产生具有催化活性的内含肽，并且还迫使靶肽形成环状构型，其稳定一个内内含肽部分和靶肽之间的连接处的氨基酸的酯异构体。然后来自另一个内含肽部分的杂原子与酯反应以形成环酯中间体。活性内含肽催化氨基琥珀酰亚胺的形成，其释放出环化形式的靶肽，该靶肽自发重排以形成热力学上有利的骨架环状肽产物。国际专利申请WO2012/156744A2公开了使用微流体液滴中的胶珠来在体外进行多步骤的隔离反应。方法可包括将包含多核苷酸、报告底物和凝胶形成剂的水性报告子溶液乳化成微液滴。每种多核苷酸编码这样的产物，其在微液滴中将报告底物转化为可检测的报告子。然后凝胶形成剂在微液滴中凝固，而产生包含多核苷酸和由产物产生的可检测的报告子的胶珠。然后将水性微液滴脱乳化并重悬于水性检测溶液中，并检测于一个或多个珠粒组群中的报告子。Cui,Weitz,Chong,等人(ScientificReports6，文章编号：22575)将体外双杂交系统(IVT2H)引入至微流体液滴，并开发出了简化的混合读取液滴IVT2H(mix-and-readdrop-IVT2H)方法来筛选随机DNA文库。液滴IV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：/na)形成含有编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室；/nb)从所述多核苷酸表达多肽；以及/nc)使所述多肽环化。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170223 GB 1702938.01.共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)形成含有编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室；
b)从所述多核苷酸表达多肽；以及
c)使所述多肽环化。


2.用于分选环状多肽的方法，包括权利要求1所述的步骤且还包括以下步骤：
c)针对活性筛选所述环状多肽；
d)选择表现出所需活性的环状多肽。


3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括扩增所述多核苷酸的步骤。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述隔室还包含凝胶形成剂，其中在扩增所述多核苷酸后，所述凝胶形成剂凝固成胶珠。


5.如权利要求4所述的方法，其中所述隔室在所述凝胶形成剂凝固成胶珠后被破坏。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述胶珠被暴露至表达所述环状多肽的条件。


7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在所述胶珠周围形成新的隔室。


8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含编码N端内含肽片段的序列，接着是编码所述环状多肽的序列，接着是编码C端内含肽片段的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿里·塔瓦索利，卡特林·苏拉比，马丁·费希尔切纳，
申请(专利权)人：南安普顿大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB