一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。该方法包括：将待检测的样品进行增菌培养，得到增菌培养液；使用试剂盒法提取增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；将待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，进行PCR反应，得到PCR反应产物；将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来判断样品是否含有单增李斯特菌。本发明专利技术基于以上引物建立了一种单增李斯特菌的PCR检测方法。本发明专利技术的检测方法具有特异性好、灵敏性高、检测速度快、成本低廉、操作简单的特点。

PCR detection of Listeria monocytogenes based on lmo1341

The invention discloses a PCR detection method of Listeria monocytogenes based on the specific gene target lmo1341. The method includes: culturing the samples to be tested to obtain the culture medium; extracting the genomic DNA of the culture medium by the kit method to obtain the DNA extract to be tested; mixing the DNA extract to be tested, the PCR primer of the Listeria monocytogenes to be tested and the PCR reaction products to obtain the PCR reaction products; agar the PCR reaction products Based on the electrophoresis results, the sugar gel electrophoresis was used to determine whether the sample contained single Lester bacillus. The invention establishes a PCR detection method of Listeria monocytogenes based on the above primers. The detection method has the advantages of good specificity, high sensitivity, fast detection speed, low cost and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。传统的基于培养的方法目前是单增李斯特菌检测的主要方法(可见国家标准GB4789.30-2016)，虽然其对实验设备的要求不高，但鉴定周期需要5-10天。使用免疫学方法鉴定虽然鉴定周期短，但操作复杂，不利于高通量检测，且单克隆抗体的制备较为困难。利用PCR方法进行单增李斯特菌的检测具有简便、快速、灵敏的特点。目前，单增李斯特菌的PCR检测使用的靶标主要是毒力基因，如hly、inlA、iap等基因。对现有专利，如CN100463972C、CN101029331B等专利中使用的检测引物使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少敏感性和特异性都较好的单增李斯特菌PCR检测引物；然而，目前对单增李斯特菌的新PCR检测靶标的挖掘的相关文献报道较少。对其新PCR检测靶标的挖掘和新的PCR检测方法的建立，有助于提高单增李斯特菌PCR检测的敏感性和特异性。
技术实现思路
本专利技术针对现有检测方法的上述不足，提供一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法。本专利技术提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法是一种特异性好、灵敏性高、检测速度快、成本低廉、操作简单的单增李斯特菌的PCR检测方法。本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。本专利技术提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其使用的特异性靶标基因为lmo1341，使用的引物序列为：lmo1341-F：5’-TGTTAGTTGATTATCCGTCGCC-3’，如SEQIDNO：1所示；lmo1341-R：5’-GCATTTACGCTCCCATTTACC-3’，如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，包括：将待测食品样品和细菌菌株进行增菌培养；使用试剂盒法提取食品样品增菌液和细菌菌液的基因组DNA；以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR反应；对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。若出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阳性，若未出现243bp的条带，则判断为单增李斯特菌阴性。本专利技术提供的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，包括如下步骤：(1)将待检测的样品接种至李斯特菌增菌肉汤中进行增菌培养，得到增菌培养液；(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；(3)将步骤(2)所述待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；(4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现243bp的条带，则步骤(1)所述待检测的样品中含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阳性；如果所述电泳结果图上没有出现条带，则步骤(1)所述待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。进一步地，步骤(1)中所述的增菌培养是使用李斯特菌增菌肉汤，在36-38℃振荡培养10-12h，其中李斯特菌增菌肉汤的成分为(以体积为一升来计)：胰蛋白胨16.0-18.0g、多价蛋白胨2.5-3.5g、酵母提取物5.0-7.0g、氯化钠4.5-5.5g、磷酸氢二钾2.0-3.0g、葡萄糖2.0-3.0g、萘啶酮酸35-45mg、吖啶黄素10-20mg，溶于1000mL蒸馏水。优选地，步骤(1)中所述的增菌培养是使用李斯特菌增菌肉汤，在37℃振荡培养10h，其中李斯特菌增菌肉汤的成分为：胰蛋白胨17.0g、多价蛋白胨3.0g、酵母提取物6.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、萘啶酮酸40mg、吖啶黄素15mg以及1000mL蒸馏水。进一步地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36-38摄氏度，增菌培养的时间为10-12h，所述增菌培养的摇床转速为210-230rpm。进一步地，步骤(2)所述待检测的DNA提取液中的DNA浓度为107.3ng/μL-107.3fg/μL。进一步地，步骤(3)所述检测单增李斯特菌的PCR引物包括PCR引物lmo1341。进一步地，所述PCR引物lmo1341包括正向引物lmo1341-F和反向引物lmo1341-R；所述正向引物lmo1341-F如SEQIDNO：1所示，所述反向引物lmo1341-R如SEQIDNO：2所示。进一步地，步骤(3)所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2-8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，在所述dNTP溶液中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10-15mM；所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液为检测单增李斯特菌的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述检测单增李斯特菌的PCR引物溶液中引物的浓度为各8-12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2-3U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水(DEPC水)。优选地，步骤(3)所述PCR体系的体积为50μL。优选地，步骤(3)所述PCR体系(以体积50μL计)包含：10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP0.25mM，引物lmo1341-F、lmo1341-R各0.2μM，模板DNA1μL，Taq酶2.5U。进一步地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：先在95-98℃预变性2-4min，然后进行扩展循环，最后在68-72℃条件下延伸4-6min；所述扩展循环为：在95-98℃条件下变性14-16s，52-54℃条件下退火14-16s，68-72℃条件下延伸29-31s，进行30-35个循环。优选地，步骤(3)所述PCR反应的条件为：先在95℃预变性3min，然后进行扩展循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）将待检测的样品接种至李斯特菌增菌肉汤中进行增菌培养，得到增菌培养液；/n（2）使用试剂盒法提取步骤（1）所述增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；/n（3）将步骤（2）所述待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；/n（4）将步骤（3）所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现243 bp的条带，则步骤（1）所述待检测的样品中含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阳性；如果所述电泳结果图上没有出现条带，则步骤（1）所述待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将待检测的样品接种至李斯特菌增菌肉汤中进行增菌培养，得到增菌培养液；
（2）使用试剂盒法提取步骤（1）所述增菌培养液的基因组DNA，得到待检测的DNA提取液；
（3）将步骤（2）所述待检测的DNA提取液、所述检测单增李斯特菌的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
（4）将步骤（3）所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现243bp的条带，则步骤（1）所述待检测的样品中含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阳性；如果所述电泳结果图上没有出现条带，则步骤（1）所述待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。


2.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤（1）所述李斯特菌增菌肉汤，以体积为一升来计，每升李斯特菌增菌肉汤中包含：胰蛋白胨16.0-18.0g、多价蛋白胨2.5-3.5g、酵母提取物5.0-7.0g、氯化钠4.5-5.5g、磷酸氢二钾2.0-3.0g、葡萄糖2.0-3.0g、萘啶酮酸35-45mg、吖啶黄素10-20mg以及1000mL蒸馏水。


3.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤（1）所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36-38摄氏度，增菌培养的时间为10-12h，所述增菌培养的摇床转速为210-230rpm。


4.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）所述待检测的DNA提取液中的DNA浓度为107.3ng/μL-107.3fg/μL。


5.根据权利要求1所述的基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）所述检测单增李斯特菌的PCR引物包括PCR引物lmo...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶燕锐，陈萍，林章凛，才艺，袁才媚，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44