基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法技术

本发明专利技术提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，包括：将荧光染料与体液混合，加样至排阻色谱柱，根据荧光强度收集馏分并合并，合并的馏分依次用蛋白酶K和RNaseA处理，最后超滤浓缩。本发明专利技术将排阻色谱法与超滤法相结合解决了排阻色谱法产物浓度偏低的问题，同时引入荧光染料作为示踪外参，不仅能够准确定位EVs所处的馏分，在进入下一步操作前还能排除因滤膜破损导致的EVs损失。本发明专利技术还提供能从体液中分离富集高纯度细胞外囊泡的试剂盒。本方法无需超速离心，即可从体液中分离获得高纯度的EVs，同时配合蛋白酶K和RNaseA处理，能有效消除体液中非囊泡来源的核酸污染，从而大幅提高细胞外囊泡的核酸纯度。

Separation and enrichment of extracellular vesicles based on exclusion chromatography and ultrafiltration

The invention provides a method for separation and enrichment of extracellular vesicles based on exclusion chromatography and ultrafiltration technology, which includes: mixing fluorescent dye with body fluid, adding sample to exclusion chromatography column, collecting and combining fractions according to fluorescence intensity, treating the combined fractions successively with protease K and RNaseA, and finally ultrafiltration concentration. The invention solves the problem of low concentration of the product of the exclusion chromatography method by combining the exclusion chromatography method with the ultrafiltration method. At the same time, the introduction of fluorescent dye as the tracer external reference can not only accurately locate the fraction of EVs, but also eliminate the EVS loss caused by the damage of the filter membrane before the next operation. The invention also provides a kit capable of separating and enriching high-purity extracellular vesicles from body fluids. This method can separate high purity EVs from body fluid without ultracentrifugation. At the same time, it can effectively eliminate the nucleic acid pollution of non vesicle source in body fluid with protease K and RNaseA treatment, thus greatly improving the nucleic acid purity of extracellular vesicles.

【技术实现步骤摘要】
基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法。
技术介绍
细胞能向外分泌具有磷脂双分子层结构的囊泡(EVs)，因其富含核酸、蛋白质、磷脂等多种生物大分子，胞外囊泡在疾病诊断和治疗方面有着广泛的应用前景。目前，胞外囊泡的提取方法主要包括，超速离心法、聚合物沉淀法、免疫捕获法、静电吸附法，排阻色谱法以及超滤法等。超速离心法因设备昂贵、操作步骤繁琐，且回收率偏低等问题，难以满足临床检验的需求。聚合物沉淀法操作简单且成本低廉，但产物纯度偏低，存在大量非囊泡来源的蛋白质及核酸。免疫捕获价格昂贵，而且受抗原表达量差异的影响显著。静电吸附法操作步骤简单，但在吸附EVs的同时也会吸附非囊泡来源的蛋白以及蛋白复合体。排阻色谱法能够根据EVs的粒径，将其与杂蛋白分离开，产物纯度高但是浓度(单位体积的EVs个数)偏低。超滤法是根据截留分子量将体液中的EVs与杂蛋白分离开，但体液中成分复杂容易堵塞滤膜，当发生滤膜破损时会导致EVs大量损失。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，包括以下步骤：1)将粒径30-120nm的荧光染料与体液混合；2)将1体积含荧光染料的体液加至平衡好的排阻色谱柱中，然后用流动相洗脱，以0.5体积为一个馏分，依次收集共14个馏分，并检测每个馏分的荧光强度，将荧光强度大于400的第1个馏分及其后2～3个馏分合并；3)向合并后的馏分中依次加入蛋白酶K和RNaseA进行处理；4)将步骤3)所得处理液加入到截留分子量100KDa的超滤管中浓缩，收集的截留物中含有富集的囊泡。前述的方法，步骤1)所述荧光染料的制备方法如下：用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的FluoresceinDHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体。将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。优选地，步骤1)中荧光染料与体液按1:250体积比混合。前述的方法，所述排阻色谱柱的填料为琼脂糖(Sepharose2B，Sepharose4B)或交联琼脂糖(SepharoseCL-2B，SepharoseCL-4B)。排阻色谱柱填料优选为交联琼脂糖Sepharose2B。优选地，排阻柱容积为6mL，填料用量5mL。前述的方法，步骤2)中所述流动相为PBS，流速为约200～500μL/min。前述的方法，步骤3)向合并后的馏分中添加终浓度10～200μg/ml的蛋白酶K，在37℃孵育10～60min，进行蛋白消化；蛋白酶K消化后，直接添加终浓度2～20μg/ml的RNaseA，室温作用10～30min，得到处理液。前述的方法，步骤4)是将步骤3)所得处理液加入到超滤管中，4000g离心15min，收集到的截留物用PBS缓冲液重悬，用于后续蛋白或核酸提取。本专利技术中，所述体液选自血浆、血清、乳汁、浓缩后的尿液、细胞培养上清、脑脊液或胸腹水等。第二方面，本专利技术提供一种用于胞外囊泡分离提取的荧光脂质体，其制备方法如下：用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的FluoresceinDHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体。将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。第三方面，本专利技术提供一种基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离、富集和提取试剂盒，所述试剂盒包括但不限于排阻色谱柱、上述荧光脂质体、超滤管、蛋白酶K、RnaseA。本专利技术原理如下：排阻色谱是一种根据待测物尺寸进行分离的色谱技术。色谱柱的固相填料是表面惰性、含有不同尺寸孔穴的立体网状凝胶。当流动相经过时，尺寸较小的物质能够渗入到孔穴中，而尺寸较大的物质因无法渗入孔穴中而被排除在外。其结果是尺寸较小的物质在色谱中停留时间会显著大于尺寸较大的物质，因此尺寸/分子量不同的颗粒会落入不同的馏分中。为确保收集正确的馏分，向体液中加入粒径30-120nm的荧光脂质体，用于EVs示踪。由于荧光脂质体与EVs具有相似的粒径尺寸，通过检测荧光强度就能够获知该馏分中EVs的丰度高低。尽管排阻色谱能有效分离EVs和杂质蛋白，但无法实现EVs的富集，最后收集的馏分体积可能高达体液起始体积的2-5倍，对于后续的核酸提取构成了较大挑战。为有效富集产物中的EVs，使用截留分子量100KDa的超滤管，对上述馏分中分子量大于100KDa的颗粒进行浓缩富集，从而有效降低了核酸提取的样本起始体积。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术将排阻色谱法与超滤法相结合解决了排阻色谱法产物浓度偏低的问题，同时通过引入荧光脂质体作为示踪外参，一方面能够准确定位EVs所处的馏分，同时能够在进入下一步操作前排除因滤膜破损导致的EVs损失。本专利技术提供的试剂盒能够从体液中分离、富集得到高纯度的细胞外囊泡(EVs)，包括尺寸排阻色谱柱、内标(类似囊泡粒径大小的荧光脂质体)、超滤管、蛋白酶K工作液、RNaseA工作液五部分组成。此外，本专利技术还公开了试剂盒的具体使用方法，本方法无需超速离心，即可从体液中分离获得高纯度的EVs，同时配合蛋白酶K和RNaseA处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将粒径30-120nm的荧光染料与体液混合；/n2)将1体积含荧光染料的体液加至平衡好的排阻色谱柱中，然后用流动相洗脱，以0.5体积为一个馏分，依次收集共14个馏分，并检测每个馏分的荧光强度，将荧光强度大于400的第1个馏分及其后2～3个馏分合并；/n3)向合并后的馏分中依次加入蛋白酶K和RNaseA进行处理；/n4)将步骤3)所得处理液加入到截留分子量100KDa的超滤管中浓缩，收集的截留物中含有富集的囊泡。/n

【技术特征摘要】
20190509 CN 20191038522601.基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将粒径30-120nm的荧光染料与体液混合；
2)将1体积含荧光染料的体液加至平衡好的排阻色谱柱中，然后用流动相洗脱，以0.5体积为一个馏分，依次收集共14个馏分，并检测每个馏分的荧光强度，将荧光强度大于400的第1个馏分及其后2～3个馏分合并；
3)向合并后的馏分中依次加入蛋白酶K和RNaseA进行处理；
4)将步骤3)所得处理液加入到截留分子量100KDa的超滤管中浓缩，收集的截留物中含有富集的囊泡。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述荧光染料的制备方法如下：
用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的FluoresceinDHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中荧光染料与体液按1:100～1:1000体积比混合，优选的体积比为1:250。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述排阻色谱柱的填料为琼脂糖Sepharose2B、Sepharose4B，或交联琼脂糖SepharoseCL-2B、SepharoseCL...

【专利技术属性】
技术研发人员：周卫，赵立波，孔关义，王德键，王耀杰，闵力，
申请(专利权)人：北京恩泽康泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11