TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法技术

本发明专利技术提供一种TRV‑based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。包括：A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；B、将DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；C、将pTRV1、重组载体分别转化农杆菌，所得转化子共同侵染植株。本发明专利技术首次证明TRV可成功应用于小报春基因沉默和功能验证，为报春花属植物的基因功能验证奠定了基础。本发明专利技术方法简单、研究周期短、无需基因全长和转化体系，获得目的表型效率高，可实现大量基因的快速功能验证。与现有的VIGS体系相比，本发明专利技术表型持续时间长，且在植株的不同部位均出现表型变化，对报春花属异型自交不亲和的遗传学研究具有重要意义。

Methods of gene silencing induced by TRV based virus in Primula

The invention provides a method for gene silencing of primroses induced by TRV \u2011 based virus. Including: A. according to the target gene of primrose, design primers and amplify the DNA fragment of the target gene; B. connect the DNA fragment to ptrv2 vector to obtain the recombinant vector; C. transform ptrv1 and the recombinant vector into Agrobacterium respectively, and the transformants infect the plant together. The invention proves for the first time that TRV can be successfully applied to the gene silencing and function verification of Primula, laying a foundation for the gene function verification of Primula. The method has the advantages of simple method, short research cycle, no need of gene full length and transformation system, high efficiency of obtaining target phenotype, and quick function verification of a large number of genes. Compared with the existing VIGS system, the phenotypic duration of the invention is long, and the phenotypic changes occur in different parts of the plant, which is of great significance to the genetic study of heteromorphic self incompatibility of Primula.

【技术实现步骤摘要】
TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体地说，涉及一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。
技术介绍
基因沉默(Genesilencing)是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)是一种转录后的基因沉默(PTGS)，由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因一致或高度同源的植物内源mRNA序列的特异性降解。VIGS技术与转基因技术相比具有操作简单和快速有效的优点，是一种较好的用于基因功能验证的反向遗传学工具。经人工改良后的烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，TRV)是目前应用最为广泛的VIGS载体。与其他病毒载体相比，TRV载体能有效地将沉默信号传递到植物的生长点，还具有沉默效率高、持续性好、寄主植物病毒症状轻等诸多优点。小报春(Primulaforbesii)所属的报春花属中约有91％的物种都存在有异型自交不亲和(hetermorphicself-incompatibility)的特性。该性状引起了科学家的兴趣。研究表明，异型自交不亲和是由S位点控制的，S位点上包含至少3个紧密连锁的基因G、P、A，其中G控制花柱高度、P控制花粉大小、A控制花药位置。由于小报春尚未建立起遗传转化体系，限制了对S位点上基因功能的研究。因此，在小报春中建立一套快速、高效的VIGS体系十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法，包括以下步骤：A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；B、将上述DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；C、将上述重组载体、pTRV1载体分别转化农杆菌，得到的转化子共同侵染植株，经检测具有病毒载体且目的基因表达量显著降低的植株，即为目标基因沉默的植株。所述报春花属植物包括但不限于小报春。所述目标基因包括但不限于八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoenedesaturase，PDS)。例如，所述DNA片段是以小报春cDNA基因组为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增得到的；所述引物F和R分别为：5’-TTAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’和5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’。(SEQIDNO:1-2)第二方面，本专利技术提供TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，包括以下步骤：1)重组载体构建：利用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到pTRV2载体中，得到重组载体pTRV2-PfPDS；2)农杆菌转化及培养：将载体pTRV1、pTRV2-PfPDS分别转化农杆菌，得到转化子TRV1、TRV2-PfPDS，进行增殖培养；3)小报春叶背注射侵染：用注射器将含有TRV1和TRV2-PfPDS的侵染液混合后注射入小报春的叶背中；4)将侵染后的幼苗培养成植株。前述的方法，步骤3)所述小报春采用培养至6-9片真叶的小苗。步骤1)具体如下：a.提取小报春叶片总mRNA，反转录成第一链cDNA；b.以第一链cDNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增得到小报春PDS基因片段；c.将上述小报春PDS基因片段构建到pTRV2载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，即得重组载体pTRV2-PfPDS。步骤3)所述的侵染液中含有200μM乙酰丁香酮、10mM氯化镁和10mM吗啉乙磺酸，pH＝5.6。其中，TRV1和TRV2-PfPDS按等比例混合。前述的方法，步骤4)包括：将侵染后的幼苗暗处理一天，第二天正常光周期养护；恒温培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃。第三方面，本专利技术提供一种TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默系统，所述基因沉默系统包括载体pTRV1以及含有小报春目标基因DNA片段的pTRV2重组载体。在本专利技术的一个具体实施方式中，TRV病毒载体介导的小报春基因沉默的方法，具体步骤如下：1、实验材料的获得：在MS培养基上播种，培养至6-9片真叶的小苗后出瓶，出瓶后小苗在人工气候室内培养，备用。培养条件：光照300μmol·m-2·s-1，16h，黑暗8h，白天温度22℃，黑暗18℃，湿度为60％。2、重组载体构建：用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组子pTRV2-PfPDS。具体步骤如下：cDNA的准备：按Trizol的方法提取小报春叶片总mRNA，按天根反转录试剂盒操作说明进行总mRNA的反转录，获得小报春cDNA，稀释20倍后，-20℃备用。小报春PDS基因片段(PfPDS)的扩增：引物设计参考In-fusion引物设计原则设计PCR引物，参见网址：http://bioinfo.clontech.com/infusion/。上游引物：5’-TAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’，下游引物：5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’，PCR产物为302bp的小报春PDS基因片段。以小报春第一链cDNA为模板，用全式金2×EasyTaqPCRSuperMix(货号：ASⅢ)进行目的片段PCR，采用50μl体系扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物进行电泳检测，并进行胶回收cDNA，-20℃备用。pTRV2-PfPDS重组载体的构建：经胶回收的cDNA与经过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切并且胶回收后的线性pTRV2质粒用In-fusion酶进行连接(参见TaKaRa公司In-FusionHDCloningKits说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素抗生素的LB平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌斑至含有100mg/L卡那霉素抗生素的液体LB中，37℃，200r/min震荡培养12h，提取质粒，测序正确的重组质粒，-20℃保存备用。3、农杆菌转化及培养；具体步骤如下：3.1将pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1载体分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV2-PfPDS、TRV2和TRV1，甘油保菌，-80℃保存备用。其中，液氮冻融法转化到农杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；/nB、将上述DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；/nC、将上述重组载体、pTRV1载体分别转化农杆菌，得到的转化子共同侵染植株，经检测具有病毒载体且目的基因表达量显著降低的植株，即为目标基因沉默的植株。/n

【技术特征摘要】
1.TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；
B、将上述DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；
C、将上述重组载体、pTRV1载体分别转化农杆菌，得到的转化子共同侵染植株，经检测具有病毒载体且目的基因表达量显著降低的植株，即为目标基因沉默的植株。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报春花属植物为小报春。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标基因为PDS基因。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA片段是以小报春cDNA基因组为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增得到的；
所述引物F和R分别为：5’-TAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’和5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’。


5.TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)重组载体构建：利用基因工程的方法将小报春PDS基因片段连接到pTRV2载体中，得到重组载体pTRV2-PfPDS；
2)农杆菌转化及培养：将载体pTRV1、pTRV2-PfPDS分别转化农杆菌，得到转化子TRV1、TRV2-PfPDS，进行增殖培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘会堂，司未佳，张启翔，申建双，刘颖，程堂仁，王佳，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11