核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化技术

本发明专利技术公开了一种核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化。所述的核酸酶蛋白Cas9的表达载体以扩增的硫氧还原蛋白‑组氨酸标签‑烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。本发明专利技术利用密码子优化和硫氧还原蛋白融合表达获得大量的核酸酶Cas9蛋白，在仅使用LB培养基的情况下，每克大肠杆菌Tuner(DE3)湿菌最后能获得10mg高纯度的活性Cas9蛋白，实现了低成本下，高保真核酸酶蛋白Cas9的高表达。本发明专利技术对宿主要求不高，获得的蛋白可以用于大批量的生物体外组装、体内基因编辑实验。

Expression vector, construction method and expression purification of nuclease protein cas9

The invention discloses an expression vector, construction method and expression purification of nuclease protein cas9. The expression vector of the nuclease protein cas9 replaces the original thioredoxin sequence in pet32a with the amplified thioredoxin \u2011 histidine tag \u2011 cDNA of the protease recognition site of tobacco etch virus, optimizes the codon into the gene sequence of cas9 which is easy to express in the host, and integrates the C-terminal NLS nuclear positioning signal peptide and 3 \u00d7 flag tag sequence into the thioredoxin sequence In the column. The invention uses codon optimization and thioredoxin fusion expression to obtain a large number of nuclease cas9 protein. Under the condition of only using LB medium, 10mg high-purity active cas9 protein can be obtained per gram of E. The invention has low requirements for the host, and the obtained protein can be used for large-scale in vitro assembly and in vivo gene editing experiments.

【技术实现步骤摘要】
核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化
本专利技术属于表达载体构建
，涉及一种核酸酶蛋白表达载体的构建，具体涉及一种核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化。
技术介绍
CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)称为规律成簇间隔短回文重复，来源于细菌，是细菌保护自身对抗病毒的一个系统，可以广泛用来删除、添加、激活或抑制各种生物体的目标基因。因此，CRISPR-Cas9是一种精确的万能基因武器。根据《High-fidelityCRISPR-Cas9nucleaseswithnodetectablegenome-wideoff-targeteffects》所知，StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9)的四个氨基酸的突变能够降低其基因编辑时的脱靶效应，但是突变位点分别为N497、R661、Q695、Q926的高保真核酸酶蛋白Cas9的蛋白酶活也会稍有下降。研究表明，可用Cas9和麦芽糖结合蛋白MBP融合表达获得活性较好、稳定性较高的Cas9蛋白。但是，由于核酸序列转录翻译时稀有密码子的存在，此表达需要特定的宿主菌；且需要大量的培养基来获得蛋白Cas9，成本较高；并且需要三次系统性的纯化步骤才能获得较纯的目标蛋白，操作复杂(AndersC,JinekM.InvitroenzymologyofCas9[J].MethodsEnzymol,2014,546:1-20.)。此外，Cas9蛋白的市场价极高，因此Cas9蛋白表达量不高限制了Cas9系统在生物体外组装、体内编辑的普及性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可基因编辑、蛋白表达量显著提高的高保真核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化。所述的载体利用密码子优化初步提高蛋白表达水平，再通过硫氧还原蛋白融合表达来提高蛋白的稳定性、折叠的正确性和蛋白的表达容量，明显提升蛋白的表达量。本专利技术的技术解决方案如下：核酸酶蛋白Cas9表达载体，以扩增的硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。所述的优化为将原有序列中的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基，即增强mRNA的稳定性、降低mRNA翻译成蛋白时中断的可能性。所述的Cas9可以是高保真突变Cas9蛋白、也可以是其他突变型的Cas9蛋白。核酸酶蛋白Cas9表达载体的构建方法，具体步骤如下：PCR扩增pET32a质粒，利用引物在硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA的5’端加上酶切位点XbaⅠ、3’端加上酶切位点XhoⅠ/SacⅠ，即△Trx-His，用限制性内切酶XbaⅠ/XhoⅠ将pET32a中原有的硫氧还原蛋白替换成△Trx-His，在Cas9的基因序列的C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列，再将修饰的Cas9蛋白的核酸序列中的部分碱基优化，在不改变氨基酸的前提下，将可能在宿主中表达过程中遇到的稀有密码子替换成常用密码子，稳定蛋白翻译水平，利用限制性内切酶XhoⅠ/SacⅠ将优化过的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中，得到核酸酶蛋白Cas9表达载体pET32a-Cas9。本专利技术还提供上述核酸酶蛋白Cas9表达载体的表达纯化方法，具体步骤如下：步骤1，核酸酶蛋白Cas9表达载体的表达：将核酸酶蛋白Cas9表达载体pET32a-Cas9转化到宿主中，挑选阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达，收集菌液，离心得到表达Cas9的菌体；步骤2，核酸酶蛋白Cas9的纯化：将表达Cas9的菌体裂解、离心，收集上清，得到阳性单克隆中可溶性蛋白Trx-Cas9融合蛋白，过滤除去细胞膜碎片和颗粒后，直接上样经Ni2+亲和层析柱纯化，收集洗脱的蛋白，得到Trx-His-Cas9融合蛋白，将纯化过的Trx-His-Cas9融合蛋白透析过夜，加入带有组氨酸标签的烟草蚀纹病毒蛋白酶TEV-His酶，酶切，经Ni2+亲和层析柱纯化，收集流穿液，获得核酸酶蛋白Cas9。所述的宿主可以是大肠杆菌Tuner(DE3)、BL21(DE3)、C43(DE3)、Star(DE3)等菌种及真核生物莱茵衣藻。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：(1)本专利技术利用密码子优化和硫氧还原蛋白融合表达获得大量的核酸酶Cas9蛋白，在仅使用LB培养基的情况下，每克大肠杆菌Tuner(DE3)湿菌最后能获得10mg高纯度的活性Cas9蛋白，成本低，操作简单。(2)本专利技术在Cas9蛋白的C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签。NLS核定位信号肽使此蛋白不仅可以用于原核生物的体内基因编辑，也可用于真核生物的体内基因编辑。而3×FLAG标签适用于大部分物种体内编辑的蛋白质免疫印迹检测。(3)本专利技术Cas9蛋白表达的宿主可以是原核生物大肠杆菌，也可以是真核生物莱茵衣藻，蛋白表达对宿主要求不高。(4)本专利技术获得的蛋白可以用于大批量的生物体外组装、体内基因编辑实验，促进生物体内单个碱基敲除技术的普及与发展。附图说明图1为△Trx-His的PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。图2为质粒pET32a-△Trx-His-Cas9的SacⅠ和XhoⅠ单酶切双酶切琼脂糖凝胶电泳结果图；第一道是DL5000DNAmarker，第二道是pET32a-△Trx-His-Cas9的SacⅠ和XhoⅠ双酶切，第三道和第四道分别是pET32a-△Trx-His-Cas9的SacⅠ和XhoⅠ单酶切。图3为构建完成的pET32a-△Trx-His-Cas9质粒图谱。图4为AKTApure纯化蛋白Cas9(HF)时的吸收图。图5为5mLHisTrap纯化后的蛋白Trx-His-Cas9(HF)的6％SDS-PAGE胶图。图6为二次NTA-Ni2+纯化后的蛋白Cas9(HF)的6％SDS-PAGE胶图，第一道为Trx-His-Cas9(HF)蛋白，第二道为蛋白Marker，第三道为流穿液，第四道为含25mM咪唑的洗脱液。图7为sgRNA转录的凝胶电泳图，第一道为DL2000DNAMarker，第二道为100ngDNA模板，第三道为100ngDNA模板转录体系中转录出的sgRNA。图8为酚/氯仿纯化后的sgRNA的凝胶电泳图。图9为psy1DNA的PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。图10为核酸酶Cas9蛋白的活性检测后的琼脂糖凝胶电泳结果图，第一道为DNAMarker，第二道为psy1DNA，第三道为未加psy1DNA的酶切体系，第四道为酶切体系酶切后的DNA。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步的说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸酶蛋白Cas9表达载体，其特征在于，以扩增的硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。/n

【技术特征摘要】
1.核酸酶蛋白Cas9表达载体，其特征在于，以扩增的硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。


2.根据权利要求1所述的核酸酶蛋白Cas9表达载体，其特征在于，所述的优化为将原有序列中的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基。


3.根据权利要求1所述的核酸酶蛋白Cas9表达载体，其特征在于，所述的Cas9选自高保真突变Cas9蛋白或其他突变型的Cas9蛋白。


4.根据权利要求1至3任一所述的核酸酶蛋白Cas9表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
PCR扩增pET32a质粒，利用引物在硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA的5’端加上酶切位点XbaⅠ、3’端加上酶切位点XhoⅠ/SacⅠ，即△Trx-His，用限制性内切酶XbaⅠ/XhoⅠ将pET32a中原有的硫氧还原蛋白替换成△Trx-His，在Cas9的基因序列的C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列，再将修饰过的Cas9蛋白的核酸序列中的部分碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，陈沐，王德孚，卢颖洪，王坤，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32