通过改善酵母中NADPH相关的生物合成途径增加人参皂苷的生产制造技术

本发明专利技术涉及通过改变Ald2、Ald6、Zwf1和Zms1而制备的具有增强的人参皂苷生产能力的酵母，制备该酵母的方法以及使用该酵母生产人参皂苷的方法。

Increase ginsenoside production by improving NADPH related biosynthesis pathway in yeast

The invention relates to a yeast with enhanced ginsenoside production capacity prepared by changing ald2, ALD6, zwf1 and ZMS1, a method for preparing the yeast and a method for producing ginsenoside using the yeast.

【技术实现步骤摘要】
通过改善酵母中NADPH相关的生物合成途径增加人参皂苷的生产
本专利技术涉及用于增加人参皂苷生产的酵母，以及使用酵母生产人参皂苷的方法。
技术介绍
皂甙是广泛存在于植物系统中的糖苷，其中非糖部分由各种环状化合物组成。三萜皂甙是人参或红参中作为主要生理活性成分含有的皂甙成分，其化学结构不同于其它植物中发现的皂甙的化学结构，因此这些人参皂甙被称为人参皂苷，具有人参糖苷的含义，以便区别于其它植物中的皂甙。根据人参皂苷的结构，可以将人参皂苷分类为三种类型：原人参二醇型(PPD型)人参皂苷，原人参三醇型(PPT型)人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷。人参的药理学研究结果已增加了公众对人参皂甙(即人参皂苷)的兴趣，因此对人参皂苷的大量生产的需求日益增长。然而，通过常规培养方法大量生产有用的人参材料存在的问题是需要4至6年的长培养期，通过遮蔽培养、旋转培养等来控制病虫害方面存在困难，因此迫切需要开发一种新的替代生产方法。最近，基于生物工程技术已经发现了许多人参皂甙相关基因，因此，使用这些基因在酵母中大量生产人参皂苷的技术的开发最近也开始受到关注。由于通过包括甲羟戊酸生物合成途径的类异戊二烯生物合成途径在植物中生物合成人参皂苷，因此通过重新设计酵母的麦角甾醇生物合成途径已经尝试了合成生物学研究以开发生产人参皂苷的菌株。最近，中国黄和张联合研究小组报告称，通过在酿酒酵母(酵母)中表达人参的原人参二醇达玛烯二醇-II合成酶基因和原人参二醇合成酶基因以及从拟南芥获得的NADPH-细胞色素P450还原酶基因成功地生产了原人参二醇(Dai,Z.等人(2013)MetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides.Metab.Eng.20:146至156.)。在未来，预计生产人参皂苷的合成酵母将能够通过更优化的工作提供成本有效的生产方法，该方法可以取代从植物中提取人参皂苷的复杂过程。在这种情况下，本专利技术人已努力使用酵母增加人参皂苷生产量。因此，他们已开发了生产人参皂苷的酵母，其中，改变NADPH生物合成相关基因的表达水平以及制备酵母的方法，并且他们已经证实，与现有的具有人参皂苷生产能力的酵母相比，该酵母可以生产增加量的原人参二醇(即人参皂苷生物合成的中间产物)，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术的一个目的是提供用于生产人参皂苷的酵母。本专利技术的另一个目的是提供一种制备该酵母的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种使用该酵母以高产率生产人参皂苷的方法。[技术方案]详细描述的优选实施方式如下。同时，本专利技术中公开的各个描述和实施方式也可以应用于其它描述和实施方式。也就是说，本专利技术中公开的各种元件的所有组合都落入本专利技术的范围内。此外，本专利技术的范围不受以下具体描述的限制。为了实现上述目的，本专利技术的一个方面提供了用于生产人参皂苷的酵母，其中，NADPH生物合成相关基因的表达水平与其内源表达水平相比改变。为了实现上述目的，本专利技术的另一方面提供了一种用于生产人参皂苷的组合物，其含有用于生产人参皂苷的酵母，其中，NADPH生物合成相关基因的表达水平与其内源表达水平相比改变。如本文所用，术语“还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)”是指一种辅酶，其作为电子供体参与氧化还原酶和脱氢酶以及NADH的许多反应，该NADH共享烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的结构，从而提供了还原能力。已知这些辅酶的氧化物(即NAD+和NADP+)具有以电子和质子的形式接收分解代谢反应中产生的能量的重要作用，并作为电子受体参与氧化还原酶反应。本专利技术的特征在于通过改变NADPH生物合成相关基因的表达水平(增加或减少)来增加人参皂苷的生产。出于本专利技术的目的，可以使用参与大量生产人参皂苷的NADPH生物合成相关基因中的任何基因，特别是用于生产原人参二醇(PPD)的基因，并没有限制。在本专利技术的实施方式中，制备其中修饰与NADPH生物合成途径相关的基因的菌株，从而证实野生型酵母细胞和转化的酵母细胞的NADPH生产量(实施例1-3)。特别地，制备各种菌株(例如，其中Ald2基因或Gdh1基因失活的菌株；其中Gnd1基因、Gdh2基因、Ald6基因、Zwf1基因或Stb5基因过表达的菌株；其中Ald2基因失活且Ald6基因过表达的菌株；其中Gdh1基因失活且Gdh2基因过表达的菌株等)以检查这些菌株中NADPH生产量是否有任何增加。NADPH生物合成相关基因可以是选自由Ald2、Gdh1、Gnd1、Gdh2、Ald6、Stb5、Zwf1和Zms1基因组成的组中的至少一种，更特别地，选自由Ald2、Ald6、Zwf1和Zms1基因组成的组中的至少一种，但NADPH生物合成相关基因不限于此。NADPH生物合成相关基因可以是9个基因、8个基因、7个基因、6个基因、5个基因、4个基因、3个基因、2个基因或1个基因。由这些基因编码的基因或酶的序列可以从已知的数据库(例如NCBI等)获得，但是可用的来源不限于此。ALD2是由Ald2基因编码的酶，其是将乙醛转化为乙酸的酶，在此过程中生产NADH。另外，ALD6是与ALD2(即同工酶)发生相同反应的酶，并且在该过程中同样生产NADPH。另外，ZMS1是由Zms1基因编码的酶，其是转录调节因子，并且已知其诱导Ald6基因的过表达。特别地，Ald2可以具有SEQIDNO：1的基因序列，并且Ald6可以具有SEQIDNO：2的基因序列，但是可以包括编码ALD2和ALD6的任何序列，并没有限制。ZWF1是由Zwf1基因编码的酶，其是戊糖磷酸途径(PP途径)中的必需酶，催化PP途径的第一步。已知ZWF1参与氧化应激并负责细胞中戊糖和NADPH的生产。特别地，Zwf1可以具有SEQIDNO：3的基因序列，并且Zms1可以具有SEQIDNO：4的基因序列，但是可以包括编码ZWF1和ZMS1的任何序列，并没有限制。另外，Gdh1、Gnd1、Gdh2和Stb5可以具有SEQIDNO：31、SEQIDNO：32、SEQIDNO：33和SEQIDNO：34的每个基因序列，但是可以包括编码GDH1、GND1、GDH2和STB5酶的任何序列，并没有限制。出于本专利技术的目的，任何参与NADPH生物合成的增加并因此能够增加基于原人参二醇(PPD)的人参皂苷的基因可以是适用的，并没有限制。另外，在本专利技术中，上述基因不仅可以包括上述那些序列，还可以包括与上述序列具有至少80％，特别是至少90％，更特别是至少95％，甚至更特别是至少99％的同源性的那些基因。另外，显而易见的是，可以包括具有与上述序列具有同源性的核苷酸序列，并且编码表现出与上述酶基本上相同或相应的效果的酶的任何基因序列，并没有限制。另外，显而易见的是，具有这种同源性的任何核苷酸序列都落入本专利技术的范围内，即使核苷酸序列可包括部分序列的缺失、修饰、取代或添加。在上文中，术语本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产人参皂苷的酵母，其中，NADPH生物合成相关基因的表达水平与其内源表达水平相比改变。/n

【技术特征摘要】
20180516 KR 10-2018-00561591.用于生产人参皂苷的酵母，其中，NADPH生物合成相关基因的表达水平与其内源表达水平相比改变。


2.根据权利要求1所述的酵母，其中，所述NADPH生物合成相关基因是选自由Ald2、Ald6、Zwf1和Zms1组成的组中的一种或多种基因。


3.根据权利要求2所述的酵母，其中，Ald2的表达水平与其内源表达水平相比减少，并且Ald6的表达水平与其内源表达水平相比增加。


4.根据权利要求3所述的酵母，其中，Zwf1的表达水平与其内源表达水平相比进一步减少。


5.根据权利要求3所述的酵母，其中，Zms1的表达水平与其内源表达水平相比进一步增加。


6.根据权利要求1所述的酵母，其中，NADPH生产能力与其内源水平相比增加。


7.根据权利要求1所述的酵母，其中，人参皂苷合成相关基因的表达水平与其内源表达水平相比进一步增加。


8.根据权利要求7所述的酵母，其中，所述基因是选自由PgDDS(人参，达玛烯二醇-II合成酶)、PgPPDS(人参细胞色素P450CYP716A47)、PgCPR(人参，NADPH-细胞色素P450还原酶)、tHMG1(酿酒酵母HMG-CoA还原酶)和PgSE(人参，角鲨烯环氧酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：金善昌，李珠映，金材应，张仁升，诸葛钟健，
申请(专利权)人：智能合成生物中心，
类型：发明
国别省市：韩国;KR