The invention discloses a preparation method of non animal source plasmid DNA, which comprises the following steps: Step 1, obtaining non animal source reagents, including non animal source culture medium and chemically synthesized antibiotics; step 2, preparing non animal source sensitive cells using non animal source culture medium; step 3, preparing non animal source RNaseA. The method of the invention can provide plasmid DNA without animal source for the field of biomedicine, better meet the requirements of laws and regulations; it can be applied to extract a large number of plasmid DNA, and make the final extracted plasmid DNA free of endotoxin and animal source pollution by using RNaseA produced by itself.
【技术实现步骤摘要】
无动物源性质粒DNA的制备方法
本专利技术涉及生物制药领域,具体涉及一种质粒DNA的制备方法,尤其涉及一种无动物源性质粒DNA的制备方法。
技术介绍
质粒DNA制备是生物制药领域,特别是抗体药生产过程中必不可少的材料,它的制备处于生物医药产业链的最前端,承载了编码药物蛋白的关键性序列。质粒制备完成后会被转染进入哺乳动物细胞(如CHOK1,HEK293T,NS0等),进而表达相应的抗体或蛋白,因此保证质粒DNA的无动物源性是基因治疗、DNA疫苗和病毒生产以及生物大分子药物生产等领域所必须的。传统的质粒DNA制备一般分为以下几个步骤:1.质粒DNA的转化;2.质粒在大肠杆菌Ecoli中扩增;3.质粒的分离纯化。目前关于质粒制备的专利主要集中于通过不同的方法来提高质粒纯度或者增加质粒产量,而没有关于生产制备无动物性质粒DNA的方案。经典的质粒DNA制备方法是使用碱裂解的方法,碱裂解法的原理是利用宿主菌染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时,线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时(酸中和),质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子,而线状DNA则与破裂的细胞壁,细菌蛋白相互缠绕成大型复合物,被SDS(十二烷基磺酸钠)包盖从而形成沉淀被离心除去。该方法由于需要完全的人为操作,抽提得到质粒纯度不高,存在RNA污染,没有去除内毒素等原因主要用于科研用途。目前已具有商业化的质粒抽提试剂盒,其原理与碱裂解法一致,但
【技术保护点】
1.一种无动物源性质粒DNA的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:/n步骤1,获得无动物源性试剂,包括无动物源性培养基,化学合成的抗生素;/n步骤2,使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞;/n步骤3,制备无动物源性RNaseA。/n
【技术特征摘要】
1.一种无动物源性质粒DNA的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,获得无动物源性试剂,包括无动物源性培养基,化学合成的抗生素;
步骤2,使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞;
步骤3,制备无动物源性RNaseA。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1和步骤2中,所述无动物源性培养基为无动物源LB液体培养基和无动物源固体LB培养基;所述无动物源LB液体培养基由以下重量份原料组成:10份大豆蛋白胨,5份酵母粉,10份NaCl;LB液体培养基加入10MNaOH调至pH7.0-7.2,高压除菌即得;所述无动物源固体LB培养基采用如下方法制得:向上述无动物源LB液体培养基加入琼脂,高压除菌。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤2具体包括如下步骤:
第1步,用无动物源固体LB培养基取感受态细胞进行划线,37°C培养16-20h;
第2步,挑取单菌落到无动物源LB液体培养基中,37°C摇床过夜培养;
第3步,取过夜菌液加入到无动物源LB液体培养基中,37°C摇床培养,使菌液OD600nm为0.3-0.6;
第4步,将菌液转移到BD管中,冰上放置10min;
第5步,4°C,离心10min倒出培养液,倒置1min;
第6步,用0.1MCaCl2-MgCl2溶液重悬细胞沉淀,冰上放置30min;
第7步,4°C,离心5min倒出培养液,倒置1mi...
【专利技术属性】
技术研发人员:牟丽丽,汪建峰,
申请(专利权)人:上海药明生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
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