一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物及制备方法，RVFV减毒疫苗技术

本发明专利技术公开了一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物及制备方法，RVFV减毒疫苗，涉及生物技术领域。该反向遗传系统避免引入多余碱基，最大限度保留了病毒基因组的原始性，同时该反向遗传系统能够后续稳定表达低毒性的裂谷热病毒株，避免了毒力恢复的缺陷，打破了传统方法需要连续传代多次才能得到减毒株的局限性。

A composition and preparation method of RVFV attenuated vaccine for preparation of RVFV

The invention discloses a composition and a preparation method of RVFV attenuated vaccine for preparing a weak virus RVFV, which relates to the field of biotechnology. The reverse genetic system avoids the introduction of redundant bases, and keeps the original genome of the virus to the maximum extent. At the same time, the reverse genetic system can stably express the virus strain of RVF with low toxicity in the follow-up, avoiding the defect of virulence recovery, and breaking the limitation that the traditional method needs to be passed on for many times to get the attenuated strain.

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物及制备方法，RVFV减毒疫苗
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物及制备方法，RVFV减毒疫苗。
技术介绍
裂谷热是由裂谷热病毒(RiftValleyfevervirus，RVFV)引起的一种急性、发热性动物源性疾病，主要经蚊虫叮咬或接触染疫动物传播，是一种人兽共患的烈性传染病。多种家畜如山羊、绵羊、牛、骆驼等可感染RVFV，可引起怀孕母畜流产、死胎等，人感染后有发热、肝炎、脑膜炎和出血综合征等症状。RVFV属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、白蛉病毒属(Phlebovirus)成员，病毒粒子直径约90nm-110nm，球形，具有囊膜，是单股负链、分节段的RNA病毒。目前，除一个兽用的减毒活疫苗(MP-12毒株)在美国被批准使用外，尚无获得许可的疫苗制剂或疗法被批准用于人类。因此，研制裂谷热疫苗已迫在眉睫。全病毒灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗以及与基因亚单位疫苗因刺激机体产生的免疫应答较弱，所以免疫效果都不及弱毒活疫苗。而在不同的细胞系中连续传代多次才能得到减毒株的传统减毒活疫苗制备方法，又存在着毒力恢复的缺陷。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物。该反向遗传系统避免引入多余碱基，最大限度保留了病毒基因组的原始性，同时该反向遗传系统能够后续稳定表达低毒性的裂谷热病毒株，避免了毒力恢复的缺陷，打破了传统方法需要连续传代多次才能得到减毒株的局限性。本专利技术的第二目的在于提供一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物的制备方法。该制备方法无酶切连接的过程，克服了传统克隆构建费时费力的繁琐操作，打破了传统构建辅助质粒来拯救病毒的繁琐弊端。本专利技术的第三目的在于提供一种弱毒的裂谷热病毒的制备方法。本专利技术的第四目的在于提供一种RVFV减毒疫苗。该减毒疫苗通过用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物制得，填补了现有技术中没有人用RVFV减毒疫苗的空白。本专利技术是这样实现的：用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物包括质粒载体，质粒载体包括质粒载体，质粒载体包括多个插入基因片段，多个插入基因片段包括第一基因片段，第二基因片段和第三基因片段，第一基因片段的DNA序列如SEQIDNO.1所示，第二基因片段的DNA序列如SEQIDNO.2所示，第三基因片段的DNA序列如SEQIDNO.3所示，插入基因片段不含有编码NSs蛋白的序列。NSs蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。第一基因片段为RVFV基因组的L片段，其编码RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)，第二基因片段为RVFV基因组的M片段，其编码至少四种蛋白：外膜糖蛋白Gn和Gc、NSm(14KDa)以及融合蛋白(78KDa)。其中，糖蛋白Gn和Gc都能刺激机体产生抗体，但是只有Gn能够产生较高的中和抗体，提供良好的免疫保护。而第三基因片段为RVFV基因组的部分S片段，完整的S片段是双义链，具有双向编码功能，完整的S片段编码核蛋白NP和一种非结构蛋白NSs。其中，NP蛋白和RdRp与基因组RNA形成核糖核蛋白(RNP)。第三基因编码NP蛋白。质粒载体的多个插入基因片段还包括第四基因片段，第四基因片段为荧光素酶报告基因、编码带有荧光标签蛋白的基因或两者的组合基因，第三基因片段与第四基因片段连接；带有荧光标签蛋白包括发射谱为420-655nm的荧光蛋白；优选的，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、深红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白中的任意一种；优选的，荧光蛋白为绿色荧光蛋白；优选的，荧光素酶报告基因可以是CAT、β-Gal、GUS、SEAP或LUC中的任意一种或多种荧光素酶报告基因的组合。第四基因片段为荧光素酶报告基因或编码带有荧光标签蛋白的基因及两种基因的组合。通过设置第四基因片段有利于质粒载体的高通量筛选，从而快速判断插入片段的表达情况。进一步地，通过设置第四基因片段与第三基因片段相连，既可以保证第三基因片段正常表达，也可以通过第四基因片段的表达实现第三基因片段的表达监控。本专利技术质粒载体通过设置上述第一基因片段，第二基因片段，第三基因片段和第四基因片段，既可以保证后续核糖核蛋白的合成，也可以保证外膜糖蛋白的合成，还可以通过荧光素酶报告基因或编码带有荧光标签蛋白的基因实现病毒活性的快速检测和筛选。通过设置插入序列不含有编码NSs蛋白的序列，使得表达后的载体缺乏毒力因子NSs，提升了细胞耐受性，降低了载体的毒力，同时又不影响正常RVFV病毒的增殖复制，仅通过荧光的检测即可实现RVFV减毒毒株的筛选。该反向遗传系统避免引入多余碱基，最大限度保留了病毒基因组的原始性，同时该反向遗传系统能够后续稳定表达低毒性的裂谷热病毒株，避免了毒力恢复的缺陷，打破了传统方法需要连续传代多次才能得到减毒株的局限性，且通过载体带有荧光素酶报告基因以及编码带有荧光标签蛋白的基因，有利于后续对RVFV减毒毒株进行高通量筛选。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述质粒载体的种类为1种，2种或者3种；优选的，质粒载体的种类为3种。当质粒载体的种类为1种时，此时，一个质粒载体中同时含有第一基因片段、第二基因片段、第三基因片段和第四基因片段共四个插入片段，四个插入片段设置于质粒载体的启动子和终止子之间，第一基因片段、第二基因片段、第三基因片段和第四基因片段的先后顺序可以根据基因表达的需求进行调整。当质粒载体的种类为2种时，此时，其中一种质粒载体中含有第一基因片段、第二基因片段、第三基因片段和第四基因片段中的任意1种或2种以上的基因片段，而另一种质粒载体含有四个插入片段剩余的一种或几种的基因片段。在本专利技术应用较佳的实施例中，当质粒载体的种类为3种时，质粒载体包括第一质粒，第二质粒和第三质粒三种质粒，其中，第一质粒包括第一基因片段，第二质粒包括第二基因片段，第三质粒包括第三基因片段和第四基因片段；优选的，第三质粒中第三基因片段和第四基因片段的方向相反。专利技术人创造性的发现，当质粒载体设置为三种质粒时病毒制备效率最高，且不会影响病毒的正常增殖，成本最低。第一质粒用于表达第一基因(L片段)，通过第一质粒表达单独的第一基因，可以保证第一基因正常表达出RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)，有利于后续核糖核蛋白(RNP)的表达。第二质粒用于表达第二基因(M片段)，通过第二质粒表达单独的第二基因，可以保证第二基因正常表达出外膜糖蛋白Gn和Gc、NSm(14KDa)以及融合蛋白(78KDa)。第三质粒用于同时表达第三基因片段和第四基因片段，第三质粒可以保证第三基因片段和第四基因片段高效转录表达，且不影响后续病毒的转染效率。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述质粒载体的空载体为pVSV-T7载体；优选的，pVSV-T7载体的5’端连接有T7启动子，3’端连接有丁肝病毒核酶序列和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括质粒载体，所述质粒载体包括多个插入基因片段，多个所述插入基因片段包括第一基因片段，第二基因片段和第三基因片段，所述第一基因片段的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二基因片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三基因片段的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述插入基因片段不含有编码NSs蛋白的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括质粒载体，所述质粒载体包括多个插入基因片段，多个所述插入基因片段包括第一基因片段，第二基因片段和第三基因片段，所述第一基因片段的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述第二基因片段的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述第三基因片段的DNA序列如SEQIDNO.3所示，所述插入基因片段不含有编码NSs蛋白的序列。


2.根据权利要求1所述的用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，质粒载体的多个所述插入基因片段还包括第四基因片段，所述第四基因片段为荧光素酶报告基因、编码带有荧光标签蛋白的基因或两者的组合基因，所述第三基因片段与所述第四基因片段连接；
所述带有荧光标签蛋白包括发射谱为420-655nm的荧光蛋白；
优选的，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、深红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白中的任意一种；
优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；
优选的，所述荧光素酶报告基因可以是CAT、β-Gal、GUS、SEAP或LUC中的任意一种或多种荧光素酶报告基因的组合。


3.根据权利要求1-2任意一项所述的用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，所述质粒载体的种类为1种，2种或者3种；
优选的，所述质粒载体的种类为3种。


4.根据权利要求3所述的用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，当所述质粒载体的种类为3种时，所述质粒载体包括第一质粒，第二质粒和第三质粒三种质粒，其中，所述第一质粒包括第一基因片段，所述第二质粒包括第二基因片段，所述第三质粒包括第三基因片段和第四基因片段；
优选的，所述第三质粒中第三基因片段和第四基因片段的方向相反。


5.根据权利要求1所述的用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物，其特征在于，所述质粒载体的空载体为pVSV-T7载体；
优选的，所述pVSV-T7载体的5’端连接有T7启动子，3’端连接有丁肝病毒核酶序列和T7终止子；所述T7启动子的序列如SEQIDNO.5所示，所述丁肝病毒核酶序列的序列如SEQIDNO.6所示，所述T7终止子的序列如SEQIDNO.7所示。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：彭珂，李淑芬，朱向涛，管真琼，张玉兰，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42