一种运动神经元及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。所述运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。本发明专利技术还公开了制备运动神经元的方法，包括以下步骤：多能干细胞向神经上皮细胞分化；神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。本发明专利技术提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。使用运动神经前体细胞冻存液，成分明确、价格低廉；复苏后细胞活力高(＞80％)，仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。

A motor neuron and its preparation and Application

The invention relates to the field of stem cell biology, in particular to a motor neuron and a preparation method and application thereof. The motor neurons, which express Olig2 +, MAP2 + and chat +, also express one or any combination of Pax6 +, Hb9 +, Isl1 +, synaptophysin + and tubulin +. The invention also discloses a method for preparing motoneurons, which comprises the following steps: pluripotent stem cells differentiate into neuroepithelial cells; neuroepithelial cells differentiate into motoneuron precursor cells; motoneuron precursor cells differentiate into post mitotic motoneurons; after mitosis motoneurons differentiate into mature motoneurons, that is to say, mature motoneurons are obtained. The preparation method of the invention does not use a system containing serum or serum substitutes; the differentiation efficiency is high and the differentiation effect is stable; the purification method is simple and the cell purity obtained is high. After resuscitation, the viability of the cells was high (> 80%) and the ability of differentiation to mature motoneurons was maintained.

【技术实现步骤摘要】
一种运动神经元及其制备方法和应用
本专利技术涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。
技术介绍
运动神经元病(motorneurondisease，MND)，是一组病因尚未明确的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质椎体细胞及椎体束的慢性退行性疾病，其病理特征为进行性上、下运动神经元的变性、坏死及凋亡。由于症状和体征的组合不同，形成不同类型的运动神经元病，包括肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)、脊肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)、原发性侧索硬化(primarylateralsclerosis，PLS)和进行性延髓麻痹(progressivebulbarpalsy，PBP)等，其中ALS是慢性运动神经元病的最常见类型，俗称“渐冻人症”。ALS具有两种形式：一种是散发的ALS(sALS)，这是最常见的ALS的形式，并占所有诊断的病例的90-95％；另一种是家族性的ALS(fALS)，这发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，占所有诊断的病例的5-10％。其特征在于在初级运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元(MN)的显著损失。运动神经元的损失会破坏基础性的基本动作，诸如呼吸，手、臂、腿或吞咽肌的肌无力，并通常在诊断以后2～5年内造成患者的死亡。针对运动神经元病的治疗，一个策略是基于可以促进神经元存活的神经营养因子(诸如胰岛素-样生长因子I(IGF-I)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Colivelin和活性依赖性的神经营养因子(ADNF)衍生的肽的神经保护和/或再生作用。多个研究结果已表明，神经营养因子在SOD1转基因小鼠中可以维持其运动神经元的功能性，因此改善运动表现。但是，这样的治疗并不能延长SOD1小鼠的存活，从而提示，神经营养因子不足以维持神经元存活(YacilaandSari.,2014)。运动神经元病的主要病理特征为特定运动神经元的损失，但是大部分运动神经元病的发病机理仍不明确，目前没有治愈的方法。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)，具有无限增殖的能力，并且在体外可以分化为几乎所有功能细胞，包括运动神经元。因此，体外通过多能干细胞诱导大规模制备纯度高的运动神经元，对于研究运动神经元病的发生机理、药物筛选、药物毒性测试等方面具有重要意义。目前已有研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为成熟运动神经元的方法，虽然可以成功诱导获得成熟运动神经元，但仍然存在培养时间长、效率低、纯度低等问题。例如，专利文献CN106701824A公开了一种基于iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法，CN107868772A公开了一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法)，CN105567636A公开了一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用。上述专利文献中诱导分化运动神经元的方法相似，都是从干细胞或神经前体细胞诱导分化获得成熟运动神经元；均在前期主要采用抑制Nodal、BMP和GSK-3信号通路进行分化，其中，CN105567636A在前期分化选择联合使用更稳定的小分子化合物。但上述专利文献中公开的方法具有以下缺点：第一，CN106701824A采用前9天拟胚体培养，后消化细胞并转至2D条件培养的方法，该过程经历了一次细胞消化过程，不仅会对细胞状态造成一定的损伤，还会损失细胞的产量；第二，CN106701824A中9天后拟胚体消化采用2D培养方法，其培养基采用的是星型胶质细胞条件培养基。星型胶质细胞条件培养基的制备不仅涉及小鼠原代星形胶质细胞的获取和培养，操作繁琐，成本较高，而且条件培养基成分复杂不清晰，批次间质量差异非常大，不利于MN的规模化生产；第三，CN106701824A中仅公开运动神经元的制备方法，并没有涉及运动神经元的冻存方法；第四，CN107868772A细胞来源是体内分离获得的运动神经前体细胞，CN105567636A细胞来源与人源脂肪干细胞的分离培养，不仅很难获得纯度较高的前体细胞，而且操作相对复杂。虽然从多能干细胞体外分化为运动神经元的过程在原理层面已经较为明确，且目前已有多种诱导分化的方法，但现有的分化方法或者存在培养时间长、效率低的问题，或者使用细胞因子等生物成分复杂且成本较高的诱导剂，因而不适于后续大量的科学研究和药物筛选。因此，亟需专利技术一种快速、高效、简便，且成本较低的诱导多能干细胞分化为成熟运动神经元的方法。
技术实现思路
为了解决现有的技术中诱导获得成熟运动神经元培养时间长、效率低或纯度低等问题，本专利技术公开了一种可快速、高效、简便从多能干细胞分化获得运动神经元的方法及应用。此外，本专利技术提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。因此，本专利技术提供的诱导分化方法非常适于科研级和临床级运动神经元的制备和研究。具体的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一个方面公开了一种运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。优选的，所述运动神经元贴壁培养。更优选的，所述运动神经元在不含血清的培养体系中铁壁培养。本专利技术第二个方面公开了一种制备上述的运动神经元的方法，包括以下步骤：S1：多能干细胞向神经上皮细胞分化；S2：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；S3：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；S4：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。优选的，步骤S1之前还包括步骤S0：多能干细胞的培养。本专利技术中制备上述的运动神经元的方法的流程图如图1所示，具体的，操作如下：一、D-3-D0：多能干细胞的培养将聚合度达到70-80％的未分化的多能干细胞用TrypLE消化成完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并接种在Vitronectin包被的孔板上，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。D-3-D0实验操作细节及优化实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的培养基E8或TeSR或其它类似培养基。按上述方法培养多能干细胞至70-80％聚合度时，使用TrypLE或Accutase消化成完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将细胞悬液接种在Vitronectin包被的孔板上，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天换液。Rock抑制剂可以是Y-27632，浓度可以为10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。


2.根据权利要求1所述的运动神经元，其特征在于，所述运动神经元贴壁培养。


3.一种制备权利要求1-2中所述的运动神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：多能干细胞向神经上皮细胞分化；
S2：神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；
S3：运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；
S4：有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1之前还包括步骤S0：多能干细胞的培养。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S1包括：
S11：将人多能干细胞的上清液吸除，加入特异性分化培养基诱导分化，并向特异性分化培养基中加入BMP抑制剂、Nodal抑制剂和GSK-3抑制剂；
S12：每天更换培养基，培养4-5天。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，BMP抑制剂、Nodal抑制剂和GSK-3抑制剂分别为LDN193189、SB431542和CHIR-99021。


7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永强，甘振磊，俞君英，张颖，胡青松，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34