一种肉牛肝细胞的原代培养方法技术

本发明专利技术属于细胞原代培养技术领域，公开了一种肉牛肝细胞的原代培养方法；肝脏组织放入含有5倍双抗的冷PBS的离心管中；放入培养皿中浸泡消毒；消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗；洗好的肝脏组织在培养皿中剪碎，培养箱中消化；加入含有10％血清的培养基终止消化；分别用100目、200目细胞筛网过滤消化液；再用400目细胞筛网过滤一次；过滤后的滤液转移到离心管中，离心；倒掉上清液，加入DMEM/F‑12生长培养基用吸管轻轻吹打细胞；把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养；肉牛肝细胞传代培养及鉴定。本发明专利技术分离培养肉牛肝细胞操作简单、成本低、对肝脏组织的样本采集要求不高。

A primary culture method of beef liver cells

The invention belongs to the technical field of cell primary culture, and discloses a primary culture method of beef liver cells; the liver tissue is put into a centrifuge tube containing 5 times of double antibody cold PBS; it is immersed in a culture dish for disinfection; the sterilized liver tissue is washed in the culture dish with PBS containing double antibody; the washed liver tissue is cut in the culture dish and digested in the culture box; it is added with 10% blood The supernatant was removed and added to DMEM / F \u2011 12 growth medium. The cells were gently blown with a straw. The evenly blown cell suspension was inoculated into the culture bottle and the culture bottle was put into the culture box; Culture and identification of hepatocytes from beef cattle. The invention has the advantages of simple operation, low cost and low requirements for sample collection of liver tissue.

【技术实现步骤摘要】
一种肉牛肝细胞的原代培养方法
本专利技术属于细胞原代培养
，尤其涉及一种肉牛肝细胞的原代培养方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：目前，牛肝细胞的培养一般采用犊牛的肝脏组织，常用两步胶原酶灌流法进行：牛屠宰后取肝脏的尾状突，用灌流液清洗后在肝脏组织中选取粗细合适的血管分别用灌流液A和灌流液B进行灌流，然后再用灌流液C进行灌流消化肝组织。还有用一步灌流结合组织消化法进行牛肝细胞的原代培养：用灌流液A和灌流液B通过血管对肝脏组织进行灌流，然后把肝脏组织剪成小块用加入Ⅳ胶原酶进行消化。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)在灌流过程中，需要结扎血管，灌流液温度保持37℃，对灌流的速度要求高，操作步骤繁琐。(2)灌流过程中需要大量的胶原酶，成本高。(3)对采集的肝脏组织要求高，需保留血管且血管粗细适宜以便于后续的灌流。(4)需要采集的肝脏组织多，不适合通过活体采集牛肝脏组织来分离牛肝细胞。(5)试验动物通常是犊牛，不适合成年牛肝细胞的分离，也无法在体外模拟成年牛肝细胞代谢相关的研究。解决上述技术问题的难度：采用胶原酶组织消化法分离培养肝细胞并保持其活性和增殖能力。解决上述技术问题的意义：采用胶原酶组织块消化法培养肉牛肝细胞操作简单、经济，不仅可以用于犊牛肝细胞的培养，而且也适合于成年牛肝细胞的分离培养，尤其可用于肉牛活体采集的肝脏组织来分离培养肝细胞，这对体外模拟研究肉牛肝脏功能及肝细胞代谢调控机制具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种肉牛肝细胞的原代培养方法。本专利技术是这样实现的，一种肉牛肝细胞的原代培养方法，所述肉牛肝细胞的原代培养方法第一步，肝脏组织，放入装有PBS的离心管中，进行清洗；第二步，肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒；第三步，消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗2-3次，一边清洗一边把肝脏组织周围的筋膜及血管剔除，把剩下的肝组织剪成小块，以去除血液；第四步，洗好的肝脏组织在培养皿中用眼科剪剪碎成1mm3，加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶在37℃培养箱中消化20-30分钟，每隔5min晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；第五步，按1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；第六步，用100目、200目细胞筛网过滤消化液，然后再用400目细胞筛网过滤一次；第七步，过滤后的滤液转移到离心管中，离心；第八步，倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞；第九步，把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养。进一步，所述第一步放入装有4℃PBS，含5倍双抗的50ml离心管中。进一步，所述第四步的Ⅱ型胶原酶浓度为1mg/mL，即0.1％。进一步，所述第七步过滤后的滤液转移到15mL离心管中，1200g离心5分钟。进一步，所述第八步的DMEM/F-12生长培养基内含10％胎牛血清，5mg/L牛胰岛素，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L地塞米松，10ng/mL表皮生长因子，100IU青霉素及0.1mg/mL链霉素。进一步，所述第九步的接种密度1.5×105个/mL，把培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养。进一步，所述第九步之后需要肉牛肝细胞密度达到80％-90％即可传代培养及鉴定。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：采用此方法分离培养肉牛肝细胞操作简单、成本低、对肝脏组织的样本采集要求不高，尤其从活体采集的牛肝组织中也可以分离培养肝细胞，为肝细胞研究奠定基础。附图说明图1是本专利技术实施例提供的肉牛肝细胞的原代培养方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的原代培养第3天的肉牛肝细胞示意图。图3是本专利技术实施例提供的传代的肉牛肝细胞示意图。图4是本专利技术实施例提供的是利用CK18抗体鉴定肉牛肝细胞示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的肉牛肝细胞的原代培养方法包括以下步骤：S101：肝脏组织，立即放入装有含5倍双抗(含500U/mL青霉素、链霉素0.5mg/mL)的4℃PBS的50mL离心管中清洗，然后置于含5倍双抗的冷PBS的离心管中迅速带回实验室分离肝细胞；S102：把肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒30秒；S103：消毒后的肝脏组织在培养皿中用含1倍双抗的PBS清洗2-3次，一边清洗一边把肝脏组织周围的筋膜及血管剔除，剩下的肝组织剪成小块，以去除血液；S104：洗好的肝脏组织在培养皿中用眼科剪剪碎成1mm3，然后加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶(浓度为1mg/mL，即0.1％)在37℃培养箱中消化20-30分钟左右(在显微镜下能够看到大量肝细胞、组织块为粘稠絮状即可)，消化过程中每隔5分钟晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；S105：按1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；S106：用100目、200目细胞筛网过滤消化液，然后再用400目细胞筛网过滤一次；S107：过滤后的滤液转移到15mL离心管中，1200g离心5分钟；S108：倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基(含10％胎牛血清，5mg/L牛胰岛素，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L地塞米松，10ng/mL表皮生长因子，100IU青霉素及0.1mg/mL链霉素)用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞；S109：把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，接种密度1.5×105个/mL，然后把培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天更换1次培养基；S110：肉牛肝细胞密度达到80％-90％即可传代培养及鉴定。下面结合实验对本专利技术的技术效果作详细的描述。如图2所示，换液除去血细胞和未贴壁的肝细胞，可见贴壁的肝细胞呈集落样生长，形状为圆形或椭圆型，可见1-2个细胞核。如图3所示，传代后的肝细胞体积增大，部分细胞仍呈集落生长，细胞有单核、双核、多核。如图4所示，利用免疫细胞化学方法对培养的原代肝细胞进行鉴定，分离培养的肝细胞经细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫荧光分析，肝细胞质内发出绿色荧光，证明培养的细胞为肝细胞。肝细胞鉴定步骤：1.肝细胞经胰酶消化后离心收集细胞沉定，再用培养基重悬制成单细胞悬液，计数后稀释至3×105个/mL备用。2.在6孔板的每个孔中央滴加100μL培养基，然后放入灭菌的盖玻片，使其恰好覆盖在孔内培养基上。3.每孔缓慢逐滴加入2mL稀释的细胞悬液，轻柔混匀，然后将6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肉牛肝细胞的原代培养方法：/n第一步，肝脏组织，放入装有PBS的离心管中，进行清洗；/n第二步，肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒；/n第三步，消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗2-3次，分成小块；/n第四步，洗好的肝脏组织在培养皿中剪碎，加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶在37℃培养箱中消化20-30分钟，每隔5min晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；/n第五步，在显微镜下观察到大量肝细胞游离出来用1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；/n第六步，用100、200目细胞筛网过滤消化液，再用400目细胞筛网过滤一次；/n第七步，过滤后的滤液转移到离心管中，离心；/n第八步，倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基用吸管吹打细胞，分散成单个细胞；/n第九步，把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肉牛肝细胞的原代培养方法：
第一步，肝脏组织，放入装有PBS的离心管中，进行清洗；
第二步，肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒；
第三步，消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗2-3次，分成小块；
第四步，洗好的肝脏组织在培养皿中剪碎，加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶在37℃培养箱中消化20-30分钟，每隔5min晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；
第五步，在显微镜下观察到大量肝细胞游离出来用1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；
第六步，用100、200目细胞筛网过滤消化液，再用400目细胞筛网过滤一次；
第七步，过滤后的滤液转移到离心管中，离心；
第八步，倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基用吸管吹打细胞，分散成单个细胞；
第九步，把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养。


2.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玲，罗宗刚，左福元，张龚炜，刘丽华，周强林，魏雷庭，袁超宇，王芳霞，颜雪琴，郑钢，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50