人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。技术要点主要包括：白斑细胞原代培养；不定期检测细胞增殖；取培养至第三代或第四代的白斑细胞，制成细胞悬液；冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。本发明专利技术在体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型，构建方法简单，可操作性强，模型状态稳定。三维模型构建，成为二维细胞实验和在体细胞实验的桥梁。

Establishment and application of three-dimensional culture model of human laryngeal leukoplakia epithelial cells

The invention belongs to the technical field of cell culture, in particular to a method for establishing a three-dimensional culture model of human laryngeal leukoplakia epithelial cells and its application. The main technical points include: primary culture of leukoplakia cells; irregular detection of cell proliferation; take the leukoplakia cells cultured to the third or fourth generation and make them into cell suspension; operate on ice, add DMEM medium into Matrigel to make diluent according to the ratio of diluent: cell suspension is 2:1 to get new cell suspension, and make the new cell suspension according to 0.6ml per hole Add to the 24 well plate; transfer the 24 well plate to 37 \u2103 cell incubator for 12 hours, add 1 ml DMEM to each well and continue to culture for 1 day. The invention successfully constructs a three-dimensional culture model of human leukoplakia epithelial cells in vitro, the construction method is simple, the operability is strong, and the model state is stable. The construction of three-dimensional model has become a bridge between two-dimensional cell experiment and in vivo cell experiment.

【技术实现步骤摘要】
人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用
本专利技术属于细胞培养
，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。
技术介绍
声带白斑是一种常见的喉癌前病变，研究表明声带白斑在不同阶段都可能发生癌变，目前喉癌前病变多以声带白斑作为研究对象。国外学者Lewin首次报道胃食管反流导致喉正常上皮组织向白斑转化可能与喉异型增生及喉癌的发生相关。国内也有研究发现咽喉反流与早期喉癌及声带白斑相关。但胃食管反流引起声带白斑的真正机制尚不清楚，以声带白斑为代表的喉癌前病变的发生、进展机制及寻找早期癌变特异性标志物，是亟待解决的临床问题。这对预防喉癌前病变发生癌变具有重要意义。常规细胞培养以细胞二维贴壁培养为主，二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从形态学、功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面都存在显著差异。细胞培养技术极大地限制了学者对声带白斑的研究的发展。目前国内、国际学者尚无针对白斑细胞进行三维培养模型构建相关报道，白斑细胞培养均为二维培养模型，二维模型细胞均为贴壁生长，与细胞在体状态存在明显差异，因此二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面均存在显著差异。再者目前部分学者提出三维培养其他细胞所使用基质胶为自主配制，自主配制基质胶存在性能不稳定性，操作繁琐性，以及配制过程污染性较高等弊端，使得培养过程无法顺利进行。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。<br>本专利技术是这样实现的，人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，包括以下步骤：步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；步骤2：不定期检测细胞增殖；步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化后制成细胞悬液；步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液；步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM1ml后继续培养1天即可。进一步，步骤1中，喉白斑组织块用无菌D-Hank’S液反复冲洗。进一步，步骤1中，组织块用D-Hank’S液反复冲洗后，用2.4mg/mlDispaseII浸没组织块。进一步，步骤1中，用酶消化法分离上皮细胞。进一步，步骤1中，消化液为胰酶和EDTA的混合物，具体配制方法为，配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液。进一步，步骤2中，用CCK-8检测细胞增殖。进一步，步骤3中，消化细胞，计数后留取1×108个细胞制成细胞悬液。进一步，步骤4中，按照1mlMatrigel基质胶中加入1mlDMEM培养基的比例制成稀释液。如权利要求1-8任一所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法在白斑细胞培养中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：相关学者报道利用Matrigel构建细胞三维模型一般为“二步法”：第一天将稀释后Matrigel放入温箱，第二天将细胞悬液滴于基质胶上，第三天模型方可构建完成。而就白斑细胞而言，其增殖速度较快，细胞爬满10cm培养皿后，消化并取细胞悬液1/4进行传代，其完全再次爬满培养皿仅需2天，之后局部细胞由于过度增殖而失去典型铺路石外观，局部细胞漂浮于培养皿中。传代后第1天，细胞即可增殖至占培养皿70％左右，且形态较好。所以取传代后第1天白斑细胞进行三维培养为最理想实验模型。另外，目前由于基质胶成本较高，三维模型建立均在24孔板中完成，相较于空间较大之培养皿而言，快速增殖的白斑细胞在相对狭小空间内，其传代时间将近一步缩短；加之基质胶的化学成分多对细胞增殖有促进作用。所以为了能在白斑细胞出现过度增殖前完成三维模型建立，必须将模型建立时间缩短，步骤简化。传统方法构建三维白斑模型，往往在模型还未构建完成时，白斑细胞已过度增殖，而失去典型外形状态或是局部以表现凋亡、衰老状态，从而影响模型建立的最终效果。本专利技术针对白斑细胞生长周期特殊性，提出一次性三维白斑模型构建，传代次日模型即可构建完成，有助于后续实验顺利进行，且使得其实验结果对临床工作有最优化的指导意义。本技术优点在于：在体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型，构建方法简单，可操作性强，模型状态稳定。三维模型构建，成为二维细胞实验和在体细胞实验的桥梁。就本专利而言，白斑细胞三维培养模型的构建，通过模拟细胞在体状态，在针对白斑细胞进行药物筛选，免疫应答，放射敏感性等研究方面，与白板细胞二维培养相比，能更好的对实际临床工作提供指导。本实验使用BD公司Matrigel基质胶作为三维培养支架，该支架成胶性能稳定，操作简便，有利于模型构建的完成与推广。本实验首次提出一次性成胶三维模型构建方法，简化了实验操作步骤。附图说明图1是实施例1中细胞形态观察结果；图2是实施例2中细胞增殖检测结果；图3是实施例3中细胞培养结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术披露了人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用，具体如下各实施例所示。实施例1白斑细胞原代培养组织处理：1.将临床取材的适宜大小组织块放入DMEM/F12培养基中，待冰冻病理确认后(喉白斑组织大部分送快速冰冻)，冰袋运输至实验室，6-24h需进行细胞分离。2.用D-Hank’S液反复冲洗3-4遍后，置于无菌小瓶中，滴加2.4mg/mlDispaseII以没过组织块为准。3.将消化后的组织块取出，用眼科镊分别夹住标本的上皮侧和结缔组织侧，轻轻用力可将上皮和皮下组织分离，用D-Hank’S液冲洗上皮片2-3遍。酶消化法分离上皮细胞：1.配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液，放入培养箱进行预温。2.将上皮组织剪成小片之后，将上述预热到37℃的无菌混合消化液倒入组织片中，放入37℃培养箱消化15-20min。3.离心(1000rpm/min，5min)，弃去上清，然后用Hank’S洗2-3遍，重复离心弃上清。4.用全培养基将细胞悬浮，100目筛网过滤细胞，然后计数，按照5*105个细胞接种到25cm2一次性培养瓶中，培养液体积大概5ml，瓶盖旋松，放入37℃，5％CO2培养箱进行培养。5.成纤维细胞的去除，成纤维细胞较上皮细胞贴壁速度快，大概1h后会出现贴壁，通过差速贴壁法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；/n步骤2：不定期检测细胞增殖；/n步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化后制成细胞悬液；/n步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液；/n步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；/n步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。/n

【技术特征摘要】
1.人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；
步骤2：不定期检测细胞增殖；
步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化后制成细胞悬液；
步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液；
步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；
步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM1ml后继续培养1天即可。


2.根据权利要求1所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于：步骤1中，喉白斑组织块用无菌D-Hank’S液反复冲洗。


3.根据权利要求2所述的人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，其特征在于：步骤1中，组织块用D-Hank’S液反复冲洗后，用2.4mg/mlDispaseII浸没组织块。


4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：周水洪，敖胤杰，鲍洋洋，钟江涛，陈哲，沈丽芳，喻而，余祺，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33