一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用，特别是可用于骨缺损和修复治疗，属于组织工程和再生医学领域。复合支架采用的是TGF‑β3‑壳聚糖‑骨胶原蛋白微球、含生物活性类人胶原蛋白的壳聚糖海绵混合冻干制备的复合支架。该复合支架具有生物相容性好，能促进损伤组织周围细胞增殖、粘附和募集体内的干细胞，适应于细胞生长及成骨分化等特点。同时本发明专利技术中，牙周膜干细胞与支架材料能够紧密结合，有助于细胞在支架材料中的良好生长，使其具有更强的成骨分化能力，能够更好地应用于骨缺损的治疗。在骨组织工程和再生医学领域，尤其是骨缺损治疗和修复等方面具有广阔的应用前景。

Preparation and application of a new type of tissue promoting repair material

The invention provides a preparation method of a new tissue promoting repair material and its application, in particular can be used for bone defect and repair treatment, belonging to the field of tissue engineering and regenerative medicine. The composite scaffold was made of TGF \u2011 \u03b2 3 \u2011 chitosan \u2011 collagen microspheres and chitosan sponge containing bioactive human collagen. The composite scaffold has good biocompatibility, can promote the proliferation, adhesion of cells around the injured tissue and the stem cells in the recruitment group, and is suitable for cell growth and osteogenic differentiation. At the same time, the periodontal ligament stem cells and the scaffold material can be closely combined, which is conducive to the good growth of cells in the scaffold material, has stronger osteogenic differentiation ability, and can be better applied to the treatment of bone defects. It has wide application prospects in the field of bone tissue engineering and regenerative medicine, especially in the treatment and repair of bone defects.

【技术实现步骤摘要】
一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用
本专利技术属于组织工程和再生医学领域，更具体地提供一种新型的促组织修复材料、其制备方法及其应用，特别是可用于骨缺损和修复治疗。
技术介绍
骨缺损是指由于创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等造成的骨结构完整性被破坏的疾病，是临床上常见的症状。通常，严重的骨缺损无法自行愈合和修复，必须借助骨修复材料才能得到有效的恢复。近年来，骨组织再生工程技术的快速发展为骨缺损的治疗和修复提供了新的途径。目前的研究表明，常见的骨组织缺损和修复的替代材料主要有天然高分子材料、人工合成高分子、无机材料、纳米材料等。上述材料各有其优缺点。其中用于骨组织工程材料的天然高分子材料主要有胶原、纤维蛋白、藻酸盐琼脂糖、壳聚糖等，它们均具有良好的生物相容性和可降解性，对人体的副作用小。根据材料的各种特性，将两种或两种以上的材料进行混合制备出性能更加优良的复合材料是骨组织工程生物支架发展的重要方向。生物医用领域中，壳聚糖支架是一种成熟支架，已用于生物医学研究多年。具有可以给细胞的生长提供空间，使其在支架上生长、繁殖，最终形成具有一定功能的器官的特点。在骨组织工程中，细胞-支架材料的构建是一个重要环节，常由于支架的粘附性、促生长和增殖特性以及生物相容性或者种子细胞的选择不当等原因造成骨缺损和修复的失败。同时，生长因子在支架中的意义也不容忽视，生长因子的类型和释放顺序对骨缺损后的修复意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于针对组织工程中生物支架材料和种子细胞选择、细胞-支架复合材料制备方法、细胞-支架复合材料与组织生物相容性等方面存在的问题，提出了一种基于hPDLSC和TGF-β3微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵复合支架的制备方法及其在骨缺损治疗和修复方面的应用。更具体地，本专利技术提供了以下各项：1.一种复合促组织修复材料(复合支架)，其包含：第一组织修复材料，所述第一组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞生长或增殖)的第一活性剂；和分散/包埋在所述第一组织修复材料中的多个颗粒，所述颗粒由第二组织修复材料组成，所述第二组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞分化)的第二活性剂，其中所述第一活性剂与所述第二活性剂不同，并且所述第一活性剂从所述第一组织修复材料的释放要早于(或释放速度要大于)所述第二活性剂从所述第二组织修复材料的释放，和/或所述复合促组织修复材料顺序释放所述第一活性剂和所述第二活性剂。2.根据以上1所述的复合促组织修复材料，其中：1)所述复合促组织修复材料是用于骨组织修复；2)所述第一组织修复材料和所述第二组织修复材料相同或不同，并且彼此独立地选自天然高分子材料、人工合成高分子材料、无机材料、纳米材料或它们的组合，优选具有生物相容性和可降解性，更优选选自胶原、纤维蛋白、藻酸盐琼脂糖和壳聚糖，最优选壳聚糖，其中所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖(海绵状)，而所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成所述颗粒，优选所述颗粒为球形(微球)；3)所述第一组织修复材料和/或所述第二组织修复材料还可以含有一种或多种促组织修复的另外的活性剂；和/或4)所述第一活性剂用于组织修复的早期阶段如细胞生长或增殖阶段，并且所述第二活性剂用于组织修复的中期或后期阶段如细胞分化阶段。3.根据以上1或2所述的复合促组织修复材料，其中所述复合促组织修复材料还包括或贴附有用于组织修复的种子细胞，其可为已分化的组织细胞(如成骨细胞)或者未分化的干细胞，优选干细胞，如骨髓基质干细胞、骨膜干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和牙周膜干细胞。4.根据以上1-3中任一项所述的复合促组织修复材料，其中：1)所述复合促组织修复材料是骨组织修复材料；2)所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖，所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成微球；3)所述第一活性剂为促进骨细胞生长或增殖的细胞因子，优选EGF(表皮生长因子)，更优选类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白；4)所述第二活性剂为促进骨细胞分化的细胞因子，优选TGF-β(转化生长因子-β)和BMP-2，更优选TGF-β3；5)所述第二组织修复材料还含有骨胶原蛋白；6)所述种子细胞为牙周膜干细胞；和/或7)所述复合促组织修复材料顺序释放EGF和TGF-β(优选TGF-β3)。5.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其中所述第二组织修复材料为TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球，其通过包括以下步骤的方法(乳化法)制备：1)制备水相和油相，其中水相包括壳聚糖(CS)醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液，油相为液体石蜡、石油醚和span80的混合物；2)将壳聚糖(CS)醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液混合均匀，之后逐滴加入所述油相中，搅拌均匀后加入戊二醛进行交联，之后静置过夜，离心去上清；3)将沉淀依次用有机溶剂和水漂洗，得到壳聚糖-骨胶原蛋白微球；和4)将得到的壳聚糖-骨胶原蛋白微球与TGF-β3溶液充分浸泡后冻干得到TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球。6.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其中所述第一组织修复材料为含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备：1)制备所述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的溶液，优选所述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；和2)将壳聚糖溶液通过冷冻干燥得到壳聚糖海绵，将其充分浸泡于上述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的溶液中，之后冻干得到含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖。7.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其通过包括以下步骤的方法制备：将以上5中定义的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球的溶液与以上6中定义的含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖充分混合，之后冷冻干燥。8.根据以上3所述的复合促组织修复材料，其中所述种子细胞为人牙周膜干细胞(hPDLSC)，优选原代牙周膜干细胞，并且将其接种至所述复合促组织修复材料上。9.根据以上1-8中任一项所述的复合促组织修复材料在制备用于组织缺损治疗或修复、特别是骨缺损治疗或修复的药物或试剂盒中的应用。10.根据以上9所述的应用，其中通过外科手术方法将所述复合促组织修复材料移植到组织缺损部位、特别是骨缺损部位。因此，本专利技术中提供了一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球-含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。通过TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球与含类人胶原-EGF融合蛋白海绵复合的方式，能够实现EGF和TGF-β3的顺序释放。早期含类人胶原-EGF融合蛋白能够为复合支架提供较优的生物相容性，其中类人胶原结构能促进牙周膜干细胞在支架材料上粘附伸展，EGF结构能促进牙周膜干细胞的增殖。后期释放TGF-β3能够促进牙周膜干细胞的成骨分化能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复合促组织修复材料，其包含：/n第一组织修复材料，所述第一组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞生长或增殖)的第一活性剂；和/n分散/包埋在所述第一组织修复材料中的多个颗粒，所述颗粒由第二组织修复材料组成，所述第二组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞分化)的第二活性剂，/n其中所述第一活性剂与所述第二活性剂不同，并且所述第一活性剂从所述第一组织修复材料的释放要早于(或释放速度要大于)所述第二活性剂从所述第二组织修复材料的释放，和/或所述复合促组织修复材料顺序释放所述第一活性剂和所述第二活性剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种复合促组织修复材料，其包含：
第一组织修复材料，所述第一组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞生长或增殖)的第一活性剂；和
分散/包埋在所述第一组织修复材料中的多个颗粒，所述颗粒由第二组织修复材料组成，所述第二组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞分化)的第二活性剂，
其中所述第一活性剂与所述第二活性剂不同，并且所述第一活性剂从所述第一组织修复材料的释放要早于(或释放速度要大于)所述第二活性剂从所述第二组织修复材料的释放，和/或所述复合促组织修复材料顺序释放所述第一活性剂和所述第二活性剂。


2.根据权利要求1所述的复合促组织修复材料，其中：
1)所述复合促组织修复材料是用于骨组织修复；
2)所述第一组织修复材料和所述第二组织修复材料相同或不同，并且彼此独立地选自天然高分子材料、人工合成高分子材料、无机材料、纳米材料或它们的组合，优选具有生物相容性和可降解性，更优选选自胶原、纤维蛋白、藻酸盐琼脂糖和壳聚糖，最优选壳聚糖，其中所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖(海绵状)，而所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成所述颗粒，优选所述颗粒为球形(微球)；
3)所述第一组织修复材料和/或所述第二组织修复材料还可以含有一种或多种促组织修复的另外的活性剂；和/或
4)所述第一活性剂用于组织修复的早期阶段如细胞生长或增殖阶段，并且所述第二活性剂用于组织修复的中期或后期阶段如细胞分化阶段。


3.根据权利要求1或2所述的复合促组织修复材料，其中所述复合促组织修复材料还包括或贴附有用于组织修复的种子细胞，其可为已分化的组织细胞(如成骨细胞)或者未分化的干细胞，优选干细胞，如骨髓基质干细胞、骨膜干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和牙周膜干细胞。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的复合促组织修复材料，其中：
1)所述复合促组织修复材料是骨组织修复材料；
2)所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖，所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成微球；
3)所述第一活性剂为促进骨细胞生长或增殖的细胞因子，优选EGF(表皮生长因子)，更优选类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白；
4)所述第二活性剂为促进骨细胞分化的细胞因子，优选TGF-β(转化生长因子-β)和BMP-2，更优选TGF-β3...

【专利技术属性】
技术研发人员：项琪，杨艳，黄亚东，李杨帆，肖巧学，
申请(专利权)人：暨南大学，广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，广州市暨源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44