用于确定靶核酸序列的存在的分析信号制造技术

本发明专利技术涉及提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法。本发明专利技术可有助于显著改善使用不同检测温度及基准值检测靶核酸序列的方法。本发明专利技术可通过去除或调整可影响靶核酸序列的检测的信号区域，以更准确、有效、可重现的方式检测靶核酸序列。

Analysis signal used to determine the existence of target nucleic acid sequence

The invention relates to a method for determining an analysis signal for the presence of a target nucleic acid sequence in a sample. The invention can help significantly improve the method of detecting target nucleic acid sequence with different detection temperature and reference value. The invention can detect the target nucleic acid sequence in a more accurate, effective and reproducible way by removing or adjusting the signal area that can affect the detection of the target nucleic acid sequence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定靶核酸序列的存在的分析信号
本专利技术涉及从在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测的信号提供用于确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。
技术介绍
为了检测靶核酸序列，作为实时检测方式广泛利用以一边监控靶扩增，一边检测靶核酸序列的实时检测方法。实时检测方法一般使用与靶核酸序列特异性杂化的已标记的探针或引物。作为利用标记的探针与靶核酸序列之间的杂化的方法的例有利用具有发夹结构的双重标记的探针的分子信标(Molecularbeacon)方法(Tyagietal.，NatureBiotechnologyv.14MARCH1996)、HyBeacon方法(FrenchDJetal.，Mol.CellProbes，15(6)：363-374(2001))、利用分别标记成供体及受体的两个探针的杂化探针方法(Bernadetal，147-148ClinChem2000；46)及使用单一标记的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本
中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法利用借助双标记的探针和脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的5‘-核酸酶活性的上述探针的切割。作为利用标记的引物的方法的例有日出(Sunrise)引物方法(Nazarenkoetal，2516-2521NucleicAcidsResearch，1997，v.25no.12，及美国专利第6117635号)、蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombeetal，804-807，NatureBiotechnologyv.17AUGUST1999及美国专利第6326145)及TSG引物方法(WO2011/078441)。作为替代方案，提出使用靶核酸序列的存在时形成的二聚物的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、第6358691号及第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOcleavageANDextension，PTOCE)方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂化(PTOCleavageandExtension-DependentSignalingOligonucleotideHybridization，PCE-SH)方法(WO第2013/115442号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂化(PTOCleavageandExtension-DependentNon-Hybridization，PCE-NH)方法(WO2014/104818)。上述的现有实时检测技术在与靶扩增相关或无关的信号扩增工序中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标记产生的信号。根据现有实时检测技术，当在一个反应管中利用单一类型的标记来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标记。在利用单一类型的标记的情况下，利用Tm值差异的解链分析可检测多个靶核酸序列。但是，解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探针的设计变得越来越困难。因此，若开发不依赖于解链分析且在单一反应容器中使用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性显著提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)的组合，能够以效率显著提高的方式在单一反应容器中使用单一类型的标记检测多个靶核酸序列。为此，本专利技术人公开了在单一反应容器中通过使用单一类型检测器来检测多个靶核酸序列的方法(WO第2015/147412号)。在上述方法中，可根据相对高温检测温度下检测的信号及相对低温检测温度下检测的信号之间的差异来确定具有相对低温检测温度的靶核酸序列的存在。尤其，基于在相对低检测温度及相对高检测温度下的信号的强度互不相同的发现，本专利技术人导入反映在不同检测温度下信号的变化关系的基准值，获得相对高温检测温度及相对低温检测温度下的信号之间的差异。典型地，使用仅包含具有相对高检测温度的靶核酸序列的对照组样品，通过重复实验获得特定范围的值后，在上述获得的值中选择适当的值来预先确定基准值。但是，观察到选择不适当的基准值可能导致一些反应中的错误结果。因此，需要开发提供用于以更加准确的方式确定靶核酸序列的存在的分析信号的新方法，以使没有这种错误的结果。在本说明书全文中，参考了多篇专利及文献，并用括号提供了其引用。为了更加明确地说明本专利技术及本专利技术所属
，这种专利及文献的内容全部插入于本说明书作为参照。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于，提供一种用于确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。本专利技术的再一目的在于，提供一种计算机可读存储介质，包含用于实现处理器的指令，上述处理器执行用于提供样品中与靶核酸序列有关的分析信号的方法。本专利技术的另一目的在于，提供一种用于提供为确定靶核酸序列的分析信号的装置。本专利技术的还有一目的在于，提供一种储存于计算机可读存储介质计算机程序，实现用于执行用于提供为确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。通过专利技术要求保护范围及附图和下述详细说明更加明确本专利技术的其他目的及优点。附图说明图1至图4为示出用于提供为确定靶核酸序列的存在的分析信号的本专利技术的实例100、实例200、实例300及实例400的流程图。图5为示出根据使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应(PCR)方法的MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)，在60℃及72℃的不同检测温度下癌检测与含100fg的淋病奈瑟菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸、100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体的混合物及NTC(非靶对照组)的样品有关的信号。图6A为示出使用式I-1从含10pg的沙眼衣原体靶的样品中提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的例。图6B为示出从图6A的所提取的信号获得用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本专利技术的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。图7A为示出使用式I-1的从含100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体靶的样品中提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的例。图7B为示出从图7A的所提取的信号获的用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本专利技术的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。图8A至图8D为示出从图5中的信号使用多种基准值(1.15、1.50、2.00或2.50)及式I-1获得的与淋病奈瑟菌靶的有关的所提取的信号(左列)，以及从根据本专利技术的实例200所提取的信号获得的与淋病奈瑟菌靶有关的分析信号(右列)。用箭头表示每个所提取的信号中的最小周期(具有最小信号值的周期)。图9为示出根据使用TaqMan实时聚合酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，包括：/n步骤(a)，在单一反应容器中，与能够产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及能够产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一起培养样品，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下通过单一类型检测器来检测信号；上述培养通过信号产生过程来进行；上述检测在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述两个信号产生机构产生的两种信号不被单一类型的检测器分辨；/n步骤(b)，通过使用第二基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；从使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应确定上述第一基准值，并从使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应确定第二基准值；/n步骤(c)，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及/n步骤(d)，提供从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170328 KR 10-2017-00393061.一种提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在单一反应容器中，与能够产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及能够产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一起培养样品，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下通过单一类型检测器来检测信号；上述培养通过信号产生过程来进行；上述检测在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述两个信号产生机构产生的两种信号不被单一类型的检测器分辨；
步骤(b)，通过使用第二基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；从使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应确定上述第一基准值，并从使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应确定第二基准值；
步骤(c)，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及
步骤(d)，提供从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。


2.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，在步骤(b)与步骤(c)之间还包括：
步骤(bc-1)，确认所提取的信号是否满足准确性基准；上述准确性基准是所提取的信号不与阈值相交；
步骤(bc-2)，若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号不满足准确性基准，则进行步骤(c)，或者若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号满足准确性基准，则不进行步骤(c)，而将所提取的信号作为分析信号提供。


3.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，在与靶核酸序列有关的适当地提取的信号示出在样品中靶核酸的存在下增加的信号模式的情况下，上述所选择的周期为具有最小信号值的周期；或者在与靶核酸序列有关的适当地提取信号示出样品中靶核酸的存在下减少的信号模式的情况下，上述所选择的周期为具有最大信号值的周期。


4.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括将从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为分析信号提供之前进行修饰的步骤。


5.根据权利要求4所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述修饰包括上移或下移从所选择的上述周期到最后周期的信号值的步骤。


6.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到不影响确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的程度并将所调整的上述多个信号值与从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值组合来作为分析信号提供的步骤。


7.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述调整包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到背景水平的步骤。


8.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述调整包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到与所选择的周期中的信号值实际上相同的步骤。


9.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括在将从第...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣祚，H·B·李，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR