能同时定量检测血液中NSE和S100B的试纸条及制备方法技术

本发明专利技术属于医学检测技术领域，涉及一种同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫层析试纸条及制备方法。通过对试纸条的改进，首次创造性地将磁性免疫层析技术引入NSE和S100B的联合检测中，结合磁信号检测仪，可同时实现对NSE和S100B的单人份定量检测，具有快速、简便、实用、高特异性及高灵敏度的特点，显著提高了脑卒中检测的精确性，即在NSE和S100B双阳性的基础上，可进一步判断脑卒中发生率，以提高对脑卒中的发生的早期诊断率及预后监测，具有较好的临床应用意义。

Test strip and preparation method for simultaneous quantitative detection of NSE and S100B in blood

The invention belongs to the technical field of medical detection, and relates to a magnetic immunochromatographic test strip and a preparation method for quantitatively detecting NSE and S100B in blood at the same time. Through the improvement of the test strip, the magnetic immunochromatography technology is creatively introduced into the joint detection of NSE and S100B for the first time. Combined with the magnetic signal detector, the single quantitative detection of NSE and S100B can be realized at the same time, which has the characteristics of fast, simple, practical, high specificity and high sensitivity, and significantly improves the accuracy of stroke detection, that is, on the basis of both NSE and S100B positive In order to improve the early diagnosis rate and prognosis monitoring of stroke, it has better clinical significance.

【技术实现步骤摘要】
能同时定量检测血液中NSE和S100B的试纸条及制备方法
本专利技术属于医学检测
，涉及一种同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
脑卒中（stroke）是人类三大死亡因素之一，且患者的数量呈逐年上升趋势，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，严重危害人民健康和生命安全，对患者家庭、财政及社会都产生巨大的负担。缺血性脑卒中（ischemicstroke）占脑卒中比例的60-80%，出血性脑卒中（hemorrhagicstroke）患者数量低于缺血性脑卒中患者，但其具有较高的致残率和较差的预后效果。因此，快速准确的早期诊断有助于治疗措施的制定进而降低脑卒中的致死率与致残率。神经成像技术(CT、MRI、TCD和PET)是临床上使用最广的诊断手段，能有效的检测并区分缺血性脑卒中和出血性脑卒中，但是仍存在一些不足和欠缺，如存在着不同程度的滞后性，不能实现超早期诊断；检测仪器昂贵，普及率不高，患者花费大；检测操作复杂、专业水平要求高等。脑卒中后发生早期脑损伤及相应的免疫应答，促使大量的细胞因子和生化分子释放入脑脊液和血液中，这些高水平的标志物对脑卒中的早期诊断具有重要的临床意义，能够实现对患者的早期诊断和早期治疗，有利于提高脑卒中的预后，另外，在治疗过程中对相关标志物进行动态监测，有助于掌握患者病情进展。因此，脑卒中相关标志物的检测具有极其重要的临床意义。NSE是神经元和外周神经内分泌细胞的高度特异性标志物，对维持神经系统的生理功能起着极为重要的作用。神经元损伤或坏死，血脑屏障通透性增加，是血清中NSE水平增高的两个主要原因，NSE是神经元损伤的生化标志物。在脑出血患者急性期，血清中NSE的浓度除了反映神经损伤程度外，在一定程度上能够提示出血性脑卒中患者的早期预后，病程中NSE明显增高者，病情凶险，如果NSE持续维持在较高水平，则临床预后不佳，相反低浓度者预后较好。在评价患者预后方面，NSE有较高的特异性和敏感性.。S100B蛋白可反映机体血脑屏障完整程度，判断神经元、胶质细胞结构的损伤程度。当脑组织受损时，S100B蛋白可释放入脑脊液并通过血脑屏障进入血液，致使其在外周血中浓度显著升高，且不受溶血干扰，十分稳定。在脑卒中患者中，出血性脑卒中S100B含量明显高于缺血性脑卒中，呈显著性差异。在发生脑卒中的6h内，出血性脑卒中患者血液中S100B的含量就开始升高，24h后达到峰值；而缺血性脑卒中在症状出现的24小时后才有显著升高。因此，S100B可以作为脑卒中早期诊断标志物，尤其是在卒中发生6小时可以区分出缺血性脑卒中和出血性脑卒中。同时，S100B的含量与出血性脑卒中的预后有关，S100B的含量越高，预后越差。
技术实现思路
本专利技术针对传统脑卒中诊断中存在的问题提出一种新型的同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫层析试纸条及制备方法。为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：一种能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条,包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及底板,所述结合垫上装载有以磁珠为标记物且分别与NSE抗体和S100B抗体偶联形成的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠；所述硝酸纤维素膜上设置有包被NSE抗体和包被S100B抗体的两条检测线以及包被有兔抗鼠IgG抗体的一条质控线。作为优选，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，相邻之间相互交错重叠2mm。一种制备上述能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条的方法，包括如下步骤：（1）将磁珠经过预处理后，分别与NSE抗体和S100B抗体偶联，制备得到抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠；（2）将样品垫用样品垫处理液浸泡，将结合垫用结合垫处理液浸泡，烘干；（3）将步骤（1）得到的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠喷涂在步骤（2）浸泡烘干过的结合垫上，烘干；（4）在硝酸纤维素膜上包被两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有NSE抗体，另一条检测线包被有S100B抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体；（5）将经过步骤（2）处理后的样品垫、步骤（3）处理后的结合垫和步骤（4）处理后的硝酸纤维素膜以及吸水纸，相邻部件之间互相部分重叠，依次组装得到磁性免疫层析试纸条。作为优选，所述步骤（1）中磁珠为羧基修饰的磁性纳米磁珠，粒径为100-300nm；磁珠预处理步骤为：使用含0.05wt%吐温20的pH=5.0，0.01M的四吗啉乙磺酸溶液洗涤，然后加入EDC和NHS活化，EDC、NHS与磁珠的摩尔比为2:2:1-5:5:1，室温活化1小时；活化结束后，使用含0.05wt%吐温20的pH=9.0，0.005M的硼酸-硼砂溶液洗涤磁珠；磁珠与抗体的偶联步骤为：以20-40μg抗体/mg磁珠的量分别加入NSE抗体、S100B抗体，室温保持4-6h，然后用含0.05wt%吐温20及1wt%BSA的pH=9.0，0.005M的BS溶液37℃封闭30h，封闭结束后，用含0.05wt%吐温20、0.05wt%叠氮化钠及1wt%BSA的pH=9.0，0.005M的BS溶液重新分散磁珠，4℃保存备用。作为优选，所述步骤（2）中样品垫处理液为含2wt%NaCl、2wt%TritonX-100、0.5wt%BSA及0.5wt%PVP的0.005M，pH为7.4-9.0的BS缓冲液；所述的结合垫处理液是含5-10wt%蔗糖、2wt%海藻糖、0.05wt%TritonX-100的0.005M，pH为7.4-9.0的BS缓冲液。作为优选，所述步骤（3）步骤为：将制备好的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠以1:1的质量比分别使用定量喷膜装置或微量移液器以30μL/cm的量均匀涂于处理好的结合垫上，然后置于25-37℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。作为优选，所述步骤（4）步骤为：使用抗体稀释液分别将NSE抗体、S11B抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度调整至0.5-2mg/mL，然后将三者用划膜仪以1μL/cm的量以0.4cm-1cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，得到两条检测线一条质控线，晾干后加入干燥剂封存备用。作为优选，NSE抗体、S100B抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度分别为1.5mg/mL、1.5mg/mL和0.5mg/mL，所述划膜仪以1μL/cm的量将NSE抗体、S100抗体和IgG抗体以0.4cm的间隔均匀喷印于硝酸纤维素膜上。作为优选，所述的抗体稀释液是含有1-2wt%蔗糖的0.01M，pH=7.2-7.6的磷酸盐缓冲液。本专利技术以磁性纳米微球为标记物质，在继承了传统免疫层析法（如胶体金，乳胶颗粒等）简便快速，单人操作的优点的基础上，提高了检测的准确度和灵敏度，解决了免疫层析只能定性、定量难的缺点，且检测时间较短，因此，本专利技术以快速、简便、实用、高特异性及高灵敏度的方法实现了对血液中二种抗原（NSE和S100B）的同时定量检测,显著提高了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条,包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及底板,其特征在于,所述结合垫上装载有以磁珠为标记物且分别与NSE抗体和S100B抗体偶联形成的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠；所述硝酸纤维素膜上设置有包被NSE抗体和包被S100B抗体的两条检测线以及包被有兔抗鼠IgG抗体的一条质控线。/n

【技术特征摘要】
1.一种能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条,包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及底板,其特征在于,所述结合垫上装载有以磁珠为标记物且分别与NSE抗体和S100B抗体偶联形成的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠；所述硝酸纤维素膜上设置有包被NSE抗体和包被S100B抗体的两条检测线以及包被有兔抗鼠IgG抗体的一条质控线。


2.根据权利要求1所述能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条，其特征在于：所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，相邻之间相互交错重叠2mm。


3.一种制备权利要求1或2所述能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将磁珠经过预处理后，分别与NSE抗体和S100B抗体偶联，制备得到抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠；
（2）将样品垫用样品垫处理液浸泡，将结合垫用结合垫处理液浸泡，烘干；
（3）将步骤（1）得到的抗NSE免疫磁珠和抗S100B免疫磁珠喷涂在步骤（2）浸泡烘干过的结合垫上，烘干；
（4）在硝酸纤维素膜上包被两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有NSE抗体，另一条检测线包被有S100B抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体；
（5）将经过步骤（2）处理后的样品垫、步骤（3）处理后的结合垫和步骤（4）处理后的硝酸纤维素膜以及吸水纸，相邻部件之间互相部分重叠，依次组装得到磁性免疫层析试纸条。


4.根据权利要求3所述能同时定量检测血液中NSE和S100B的磁性免疫试纸条的方法，其特征在于，所述步骤（1）中磁珠为羧基修饰的磁性纳米磁珠，粒径为100-300nm；磁珠预处理步骤为：使用含0.05wt%吐温20的pH=5.0，0.01M的四吗啉乙磺酸溶液洗涤，然后加入EDC和NHS活化，EDC、NHS与磁珠的摩尔比为2:2:1-5:5:1，室温活化1小时；活化结束后，使用含0.05wt%吐温20的pH=9.0，0.005M的硼酸-硼砂溶液洗涤磁珠；磁珠与抗体的偶联步骤为：以20-40μg抗体/mg磁珠的量分别加入NSE抗体、S100B抗体，室温保持4-6h，然后用含0.05wt%吐温20...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，杨明峰，孙保亮，范存东，张宗勇，袁慧，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37