一种体外培养结核感染T细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外培养结核感染T细胞的方法，采集外周静脉新鲜全血后，立刻与抗凝剂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解。再用离心机离心去除上层血浆，在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀。用离心机离心后，吸走上层培养基液1。然后在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀。再按空白对照管N，测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL的以上含有培养基液2的血细胞样本，立刻颠倒混匀，使培养管内物质充分混匀。将以上3种培养管直立放入恒温培养箱中培养。培养结束后，将培养管用离心机离心，取上层培养基液2检测各培养管中γ‑干扰素的浓度。

A method of culturing tuberculosis infected T cells in vitro

The invention discloses a method for culturing tuberculosis infected T cells in vitro. After collecting fresh whole blood from peripheral vein, it immediately reverses and mixes with anticoagulant to make anticoagulant fully dissolved. Then centrifugation was used to remove the upper plasma, and an equal volume of endotoxin free serum-free medium (1) was added to the blood cells to fully mix. After centrifugation, remove the upper medium 1. Then add the same volume of plasma medium 2 without endotoxin and serum to the separated blood cells, and mix it well. Then according to the sequence of blank control tube n, test tube T and positive control tube P, add more than 1ml of blood cell samples containing medium 2 into the three kinds of culture tubes respectively, and mix them upside down immediately to make the substances in the culture tubes fully mixed. Put the above three culture tubes in a constant temperature incubator. At the end of culture, centrifuge the culture tubes and take the upper medium 2 to detect the concentration of IFN - \u03b3 in each tube.

【技术实现步骤摘要】
一种体外培养结核感染T细胞的方法
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种体外培养结核感染T细胞的方法。
技术介绍
目前检测结核感染T细胞的方法有两大类，一种为免疫斑点法；另一种为体外释放免疫法。免疫斑点法采用体外分离到T淋巴细胞后，培养增殖T细胞的同时用相应特异抗原进行刺激。全血中或分离到的T细胞中的结核感染T细胞被相应特异性抗原激活记忆；有记忆的细胞会分泌γ干扰素；通过检测γ干扰素的量，来判断该细胞是否有结核感染形成的记忆，进一步反映是否有结核感染。免疫斑点法的细胞培养要求较高，需要二氧化碳培养箱，操作步骤复杂，结果以斑点计数判断，自动化程度低，其实验体系中的外周血单个核细胞分离、加入活体细胞数量、细胞孵育条件、结果判定等全程质量控制，是决定实验成败的关键所在。传统的体外释放法将全血加入到相应特异性抗原的培养管中，采用全血培养，因某些受检者血液中本身含有较高的γ干扰素，从而会导致本底升高，对结果的判读产生误判。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种体外培养结合感染T细胞的方法。克服了传统全血培养方法中受检者全血中本身存在的γ-干扰素的干扰，导致本底升高，造成结果误判的技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种体外培养结核感染T细胞的方法，包括以下步骤：第一步：采集外周静脉新鲜全血，将采集的全血与抗凝剂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解；第二步：离心，去除上层血浆，保留细胞层；第三步，在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀，离心，吸走上层的无内毒素无血清培养基液1；第四步：在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀；第五步：按空白对照管N、测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL含有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本，使培养管内物质充分混匀；第六步：将加有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本的3种培养管直立放入恒温培养箱中培养；第七步：培养结束后，将培养管离心，取上层无内毒素无血清培养基液2检测各培养管中γ-干扰素的浓度。进一步地，所述抗凝剂为肝素钠或肝素锂。进一步地，所述无内毒素无血清培养基液1的主要成分为无机盐、氨基酸、维生素的一种或多种。进一步地，所述无内毒素无血清培养基液2的主要组分为无机盐、氨基酸、维生素以及细胞因子。进一步地，所述恒温培养箱的培养温度为37(±1)℃。进一步地，所述培养管在恒温培养箱的培养时间为16～24小时。进一步地，所述无机盐包含但不限于以下几种：硝酸钙、无水硫酸镁、无水磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠。进一步地，所述氨基酸包含但不限于以下几种：L-精氨酸、L-门冬酰胺、L-门冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺。进一步地，所述维生素包含但不限于以下几种：生物素、D-泛酸钙、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、氯化胆碱、盐酸硫胺素、维生素B12、对氨基苯甲酸。进一步地，所述生长因子包括以下一种或几种：成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子和转化生长因子。相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1)克服了传统全血培养方法中受检者全血中本身存在的γ-干扰素的干扰，有效降低了本底，提高了分辨率和灵敏度；2)避免了免疫斑点法中体外分离T淋巴细胞时的操作步骤复杂，培养条件要求高的限制；3)本专利技术方法具有操作简单，重复性好，培养方法简便，分辨率和灵敏度高等特点。具体实施方式一种体外培养结核感染T细胞的方法，包括以下步骤：第一步：采集外周静脉新鲜全血，将采集的全血与抗凝剂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解；第二步：离心，去除上层血浆，保留细胞层；第三步，在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀，离心，吸走上层的无内毒素无血清培养基液1；第四步：在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀；第五步：按空白对照管N、测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL的以上含有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本，颠倒混匀，使培养管内物质充分混匀；第六步：将加有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本的3种培养管直立放入恒温培养箱中培养；第七步：培养结束后，将培养管离心，取上层无内毒素无血清培养基液2检测各培养管中γ-干扰素的浓度。进一步地，所述抗凝剂为肝素钠或肝素锂。进一步地，所述无内毒素无血清培养基液1的主要成分为无机盐、氨基酸、维生素的一种或多种。进一步地，所述无内毒素无血清培养基液2的主要组分为无机盐、氨基酸、维生素以及细胞因子。进一步地，所述恒温培养箱的培养温度为37(±1)℃。进一步地，所述培养管在恒温培养箱的培养时间为16～24小时。进一步地，所述无机盐包含但不限于以下几种：硝酸钙、无水硫酸镁、无水磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠。进一步地，所述氨基酸包含但不限于以下几种：L-精氨酸、L-门冬酰胺、L-门冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺。进一步地，所述维生素包含但不限于以下几种：生物素、D-泛酸钙、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、氯化胆碱、盐酸硫胺素、维生素B12、对氨基苯甲酸。进一步地，所述生长因子包括以下一种或几种：成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子和转化生长因子。实施例1体外培养结核感染T细胞的方法采集外周静脉新鲜全血，然后立刻与抗凝剂肝素钠或肝素锂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解，用离心机在3000～5000r/min的转速离心5～10min，去除上层血浆，保留细胞层。之后在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀，用离心机在3000～5000r/min的转速离心5～10min，轻轻吸走上层无内毒素无血清培养基液1。然后在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀。按空白对照管N，测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL含有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本，立刻颠倒混匀，使培养管内物质充分混匀。将以上加有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本的3种培养管直立放入37±1℃恒温培养箱中培养16～24小时。培养结束后，将培养管以3000～5000r/min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外培养结核感染T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n第一步：采集外周静脉新鲜全血，将采集的全血与抗凝剂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解；/n第二步：离心，去除上层血浆，保留细胞层；/n第三步，在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀，离心，吸走上层的无内毒素无血清培养基液1；/n第四步：在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀；/n第五步：按空白对照管N、测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL含有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本，使培养管内物质充分混匀；/n第六步：将加有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本的3种培养管直立放入恒温培养箱中培养；/n第七步：培养结束后，将培养管离心，取上层无内毒素无血清培养基液2检测各培养管中γ-干扰素的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外培养结核感染T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步：采集外周静脉新鲜全血，将采集的全血与抗凝剂颠倒混匀，使抗凝剂充分溶解；
第二步：离心，去除上层血浆，保留细胞层；
第三步，在血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液1，充分混匀，离心，吸走上层的无内毒素无血清培养基液1；
第四步：在分离后的血细胞中加入血浆等体积的无内毒素无血清培养基液2，充分混匀；
第五步：按空白对照管N、测试管T和阳性对照管P的顺序，在3种培养管中分别加入1mL含有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本，使培养管内物质充分混匀；
第六步：将加有无内毒素无血清培养基液2血细胞样本的3种培养管直立放入恒温培养箱中培养；
第七步：培养结束后，将培养管离心，取上层无内毒素无血清培养基液2检测各培养管中γ-干扰素的浓度。


2.根据权利要求1所述的一种体外培养结核感染T细胞的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素钠或肝素锂。


3.根据权利要求1所述的一种体外培养结核感染T细胞的方法，其特征在于，所述无内毒素无血清培养基液1的主要成分为无机盐、氨基酸、维生素的一种或多种。


4.根据权利要求1所述的一种体外培养结核感染T细胞的方法，其特征在于，所述无内毒素无血清培养基液2的主要组分为无机盐、氨基酸、维生素及细胞因子。


5.根据权利要求1所述的一种体外培...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭玉华，江燚，刘灿，邢晓敏，冯淑怡，冯健明，孙勇，
申请(专利权)人：广州市丰华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44