NIR荧光探针的改进合成制造技术

本发明专利技术涉及近红外(NIR)荧光探针(式(I)的cRGD‑Cy5.5缀合物，称为“DA364”)的合成方法，所述探针包含用Cy5.5染料部分标记的基于氮杂‑双环烷烃的环肽，且用于肿瘤和病理区域的引导手术。

Improved synthesis of NIR fluorescent probe

The invention relates to a synthesis method of a near-infrared (NIR) fluorescent probe (crgd \u2011 cy5.5 conjugate of formula (I), which is called \da364\), comprising a cyclic peptide based on aza \u2011 bicyclalkane partially labeled with cy5.5 dye, and is used for guiding surgery in tumor and pathological areas.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NIR荧光探针的改进合成专利
本专利技术涉及光学成像领域。更具体地，本专利技术涉及一种改进的近红外(NIR)荧光探针(称为“DA364”)的合成方法，所述探针包含用Cy5.5染料部分标记的基于氮杂-双环烷烃的环肽，且用于肿瘤和病理区域的引导手术。背景DA364(参见下面的式I)是在术中成像中有效使用的NIR荧光剂，以在肿瘤的NIR荧光成像引导的治愈性手术期间提供肿瘤边缘的实时检测和分界。DA364的合成(参见Lanzardo等，ContrastMediaMol.Imaging2011,6,449-458)涉及琥珀酰亚氨酯(VI)(Cy5.5-NHS)与通过催化还原相应的叠氮化合物(II)得到的肽模拟物(VII)(氨基环状cRGD)的反应，其按照下列反应方案1：然而，该方法在扩大规模、时间和成本方面存在一些缺点。特别地，Cy5.5-NHS(VI)的合成是漫长的，且最终的花青NHS酯难以纯化，导致总产率低。此外，作为活化酯，它是不稳定的并且不能成功地作为干燥固体储存，因此需要在使用前立即合成。另外，从化合物(IIa)合成氨基-环状cRGD(VII)需要若干步骤，不仅是用于氢化的步骤，还有用于脱保护和从任何副产物中经制备型HPLC对脱保护的化合物(VII)进行纯化的步骤。粗制DA364也必须经制备型HPLC纯化，以避免副产物的存在。申请人现在开发了一种改进的DA364合成，从Cy5.5-COOH衍生物开始代替Cy5.5-NHS，并将cRGD氨基酸上的保护基保持到偶联反应，这可以克服目前已知制备方法的一些缺点。通常，在现有技术中已经公开了在偶联剂存在下非活化羧酸和胺之间的直接酰胺偶联作为制备成像探针的替代方法：例如，引用于BaiM.等人,Curr.Med.Chem.2012,19(28),4742-4758中。用这种方法获得的缀合物的一些实例也在名称为KoreanInstituteofScienceandTechnology的US2014/288300A1和Chevalier等人,Org.Lett.2014,16,3946-3949中公开，报道了在偶联剂如HATU或PyBOP存在下制备具有荧光团-COOH和胺的缀合物。然而，在
技术介绍
中没有发现暗示提供将该方法应用于DA364的整个合成的成功预期，其目的是解决上述缺点并获得产率以及该方法的时间和成本的改进。定义在本说明书中，除非另有说明，术语“偶联剂”是指用于在羧基部分和氨基部分之间形成酰胺键的试剂。该反应由两个连续步骤组成：羧基部分的活化，然后是氨基的酰化。偶联试剂通常至少包括鏻、铵、亚铵、二酰亚胺官能团，它们能够与各自的羧基反应，得到被氨基部分攻击的中间体。偶联剂的实例报道如下。表述“无水极性非质子溶剂”包括具有相对大的介电常数(例如>20)的干燥溶剂，其具有由极性键引起的偶极子但不具有可以提供给H键的H原子。无水极性非质子溶剂的实例包括，例如，N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈。表述“酸清除剂混合物”在其含义内包括适用于除去一些保护基团的裂解酸试剂混合物，特别是Mtr(2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基)、Pmc(2,2,5,7,8-五甲基-6-苯并二氢吡喃-磺酰基)、OtBu(叔丁基酯)、Trt(三苯基甲基)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基)。以下报道酸清除剂混合物的实例。专利技术概述本专利技术涉及制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法其包括以下步骤：a)氢化式(II)的化合物其中Mtr是2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯-磺酰基，得到式(III)的其氨基-衍生物其中Mtr如上所定义；b)在碱和偶联剂存在下，使式(III)化合物与式(IV)化合物反应得到式(V)的化合物其中Mtr如上所定义；c)使式(V)化合物脱保护，得到式(I)化合物。作为本专利技术目的的新合成方法提供了制备DA364的最有效方法，其最终产率提高了至少12％，并提供了几种在工业规模生产中特别有利的改进。实际上，选择反应性较低但更稳定的Cy5.5-COOH衍生物代替Cy5.5-NHS，可以在没有降解问题的情况下保存原料。此外，出乎意料地，仅在花青与cRGD肽偶联后去除氨基酸保护基团的策略被证明是有益的出于以下几个原因：例如它避免形成不希望的副产物；它避免了叠氮化合物(II)的纯化步骤，其原样使用而无需纯化；它有助于从未反应的花青中色谱分离和纯化缀合物，这还可以很容易地回收和再循环。最后，偶联可以在无水极性非质子溶剂中而不在硼酸盐缓冲剂中进行，再次提供储存中间体而不降解的机会。即使在没有先前的教导的情况下，也令人惊讶地获得了上述几项成就。特别地，在现有技术中没有发现关于cRGD-Cy5.5缀合物对在酸清除剂混合物存在下进行的最终脱保护步骤中所应用的强酸条件的稳定性的证据。然而，本专利技术提供了一种方法，其中即使在强酸性条件下，DA364也以良好的产率获得并且没有降解。此外，由于去除了不方便的例如在偶联之前的HPLC制备步骤，或快速色谱法的更容易的添加和更快的纯化，本专利技术方法中的纯化步骤大大简化。事实上，令人惊讶地发现，使用例如用琼脂糖基质树脂进行的阴离子交换色谱法，可以将最终的缀合物化合物与非偶联的花青分离，从而改善随后的HPLC纯化步骤，专利技术详述本专利技术公开了制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法，其在本领域中称为DA364，如以下方案2所示：本方法的第一个步骤涉及中间体化合物(II)的氢化以获得受保护的cRGD化合物(III)。与Lanzardo等人公开的方法不同，不除去化合物(III)的天冬氨酸和精氨酸上的保护基，以避免副产物的形成，使得不需要纯化。叠氮化合物(II)可以例如根据Manzoni等人.,Chem.Med.Chem2009,4,615-632中描述的方法合成。根据步骤a)，化合物(II)因此溶解在合适的溶剂中，优选醇例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、更优选甲醇或它们的混合物。通常，叠氮化物可以以3mM至7mM、优选5至5.5mM、更优选5mM的浓度溶解。化合物(II)的叠氮基还原为化合物(III)的氨基可以通过在氢气氛下在室温使溶液流过(例如0.2-0.8ml/min、优选0.5ml/min)金属催化剂(例简形式)来进行。金属催化剂优选为钯或铂，更优选为钯。在一个优选的实施方案中，将金属催化剂与合适的载体材料例如碳粉混合，优选的量为5-10％(重量)的金属催化剂。反应可在18℃至40℃、优选20℃至30℃的温度进行，甚至在室温(即约22℃)进行。反应可在流动反应器系统(连续模式)或分批条件下进行。该方法的第二个步骤包括将Cy5.5的羧酸(中间体化合物(IV))与化合物(III)的氨基偶合，得到粗制的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170413 EP 17166432.91.制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法



其包括以下步骤：
a)氢化式(II)的化合物



其中Mtr是2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯-磺酰基，得到式(III)的其氨基-衍生物



其中Mtr如上所定义；
b)在碱和偶联剂存在下，使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应



得到式(V)的化合物



其中Mtr如上所定义；
c)使式(V)的化合物脱保护，得到式(I)的化合物。


2.根据权利要求1的方法，其中将式(II)的化合物溶解在溶剂中，所述溶剂是醇或醇的混合物。


3.根据权利要求1或2的方法，其中式(II)的化合物的浓度为3-7毫摩尔。


4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤a)通过在氢气氛下使溶解在溶剂中的式(II)的化合物流过金属催化剂来进行。


5.根据权利要求1的方法，其中步骤a)在18℃至40℃的温度进行。


6.根据权利要求1的方法，其中步骤b)在选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮和乙腈的溶剂的存在下进行。


7.根据权利要求1的方法，其中偶联剂选自N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐(TBTU)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·拉图阿达，F·波桑蒂，F·克里韦林，F·费雷蒂，F·马伊萨诺，L·奥里奥，L·皮兹图特，
申请(专利权)人：伯拉考成像股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT