利用不同检测温度的靶核酸序列检测制造技术

本发明专利技术涉及利用不同检测温度的靶核酸序列检测。在利用不同检测温度的本发明专利技术中，在1个反应容器中仅用单一类型的标记以现有的实施方式也可检测多个靶核酸序列。在现有技术中，在靶扩增后通过解链分析检测多个靶核酸序列。与此不同地，本发明专利技术在靶扩增后无需进行解链分析，从而显著缩短分析时间。

Target nucleic acid sequence detection using different detection temperature

The invention relates to target nucleic acid sequence detection using different detection temperatures. In the invention using different detection temperatures, multiple target nucleic acid sequences can also be detected in one reaction vessel with only a single type of marker in the existing embodiment. In the prior art, after target amplification, a plurality of target nucleic acid sequences are detected by chain breaking analysis. In contrast, after target amplification, the present invention does not need to carry out chain breaking analysis, so as to significantly shorten the analysis time.

【技术实现步骤摘要】
利用不同检测温度的靶核酸序列检测本申请是申请日为2014年12月9日、专利技术名称为“利用不同检测温度的靶核酸序列检测”的中国专利技术专利申请No.201480077317.3的分案申请。
本专利技术涉及利用不同检测温度的靶核酸序列检测。
技术介绍
为了检测靶核酸序列，广泛利用以实时方式一边监控靶扩增，一边可检测靶核酸序列的实时检测方法。通常，在实时检测方法中利用与靶核酸序列特异性杂交的已标记的探针或引物。作为利用已标记的探针及靶核酸序列之间的杂交的方法的例，包括利用具有发夹结构的双重标记的探针的分子信标(Molecularbeacon)方法(Tyagi等，NatureBiotechnologyv.14MARCH1996)、HyBeacon方法(FrenchDJ等，Mol.CellProbes,15(6):363-374(2001)、利用2个分别标记成供体(donor)及受体(acceptor)的2个探针的杂交探针方法(Bernad等，147-148ClinChem2000；46)及利用单一标记的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本
中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)利用借助双重标记的探针和脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探针的切割。作为利用标记的引物的方法的例，包括日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko等，2516-2521NucleicAcidsResearch,1997,v.25no.12及美国专利第6117635号)及蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombe等，804-807,NatureBiotechnologyv.17AUGUST1999及美国专利第6326145号)及TSG引物方法(WO2011-078441)。作为代替接近法，提出利用以依赖于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚物的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、美国专利第6358691号及美国专利第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOcleavageandextension；PTOCE)方法(WO2012/096523)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PTOCleavageandExtension-DependentSignalingOligonucleotideHybridization；PCE-SH)方法(WO2013/115442)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PTOCleavageandExtension-DependentNon-Hybridization；PCE-NH)方法(PCT/KR2013/012312)。如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相相关或无关的信号扩增过程中，在1个所选择的检测温度下检测从荧光标记产生的信号。根据现有实时检测技术，在一个反应管中利用单一类型的标记来检测多个靶核酸序列时，互不区别针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标记。在利用单一类型的标记的情况下，利用Tm差异的解链分析可检测多个靶核酸序列，但是，解链分析具有如下缺点：解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探针的设计变得越来越难。因此，若开发不依赖于解链分析且在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，若结合上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)，则能够以效率大大提高的方式在1个反应容器中利用单一类型的标记检测多个靶核酸序列。在本说明书全文中，参照了多篇专利及文献，并用括号表示了其引用。为了更加明确地说明本专利技术及本专利技术所属
的水平，这种专利及文献的公开内容全插入于本说明书作为参照。
技术实现思路
本专利技术人为了开发在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的新方法而进行了努力研究。研究结果，本专利技术人在调节的检测温度下获得针对靶核酸序列的信号后，通过合适地分析检测结果确认到能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式在1个反应容器中利用单一类型的标记及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。因此，本专利技术的目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内2个靶核酸序列的方法及试剂盒。本专利技术的再一目的在于，提供利用不同检测温度来对试样内核酸序列的核苷酸多态性(SNP)基因型进行分析的方法及试剂盒。本专利技术的还一目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。本专利技术的另一目的在于，提供利用不同检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。本专利技术的又一目的在于，提供利用检测温度分析及解链分析检测至少3个靶核酸序列的方法及试剂盒。本专利技术的又一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于利用不同检测温度确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法。本专利技术的又一目的在于，提供利用不同检测温度检测试样内靶核酸序列的装置。本专利技术的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于确定试样内2个靶核酸序列的存在的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质。本专利技术的又一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于利用不同检测温度确定试样内3个靶核酸序列的存在的方法。与所附的专利技术要求保护范围及附图一同，通过以下详细说明可使本专利技术的其他目的及优点更加明确。附图说明图1a为示出为了检测具有相对较高检测温度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原体(CT，Chlamydiatrachomatis)的基因组脱氧核糖核酸)、具有相对较低检测温度(60℃)的靶核酸序列(淋球菌(NG，Neisseriagonorrhoeae)基因组脱氧核糖核酸)及它们的组合而利用不同检测温度的本专利技术的检测结果的图。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应(PCR)方法产生针对上述沙眼衣原体及淋球菌的信号。图1b为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。图1c为示出通过对相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的比率进行浮动来确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图。图1d及图1e为示出通过相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号之间的差异确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的图，将上述相对较高检测温度下的信号变形成阈值且用于获得上述差异。图2a为示出为了检测具有相对较高检测温度(72℃)的靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸)、具有相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：/n步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的2个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度下进行上述检测；/n步骤(b)，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，进行对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析；以及/n步骤(c)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，在上述步骤(b)中，利用解链分析结果确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。/n...

【技术特征摘要】
20140328 KR 10-2014-0037310;20140509 KR PCT/KR20141.一种利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述2个靶核酸序列的2个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生的信号，借助相应的信号-产生机构检测各个上述靶核酸序列，上述2个靶核酸序列的一个具有借助相应的信号-产生机构确定的相对较高检测温度，另一个具有借助相应的上述信号-产生机构确定的相对较低检测温度，上述相对较高检测温度为能够产生针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，上述相对较低检测温度为能够产生针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号以及具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述2个信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，在上述相对较高检测温度下进行上述检测；
步骤(b)，为了确定具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，进行对上述步骤(a)的培养结果物的解链分析；以及
步骤(c)，根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的存在，在上述步骤(b)中，利用解链分析结果确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。


2.根据权利要求1所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产生信号的信号-产生机构。


3.根据权利要求1所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对具有上述相对较高检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于检测寡核苷酸的切割的信号-产生机构，针对具有上述相对较低检测温度的靶核酸序列的信号-产生机构为基于二聚物形成的信号-产生机构。


4.根据权利要求1所述的利用不同检测温度及解链分析检测试样内2个靶核酸序列的方法，其特征在于，上述2个信号-产生机构包含相同的标记，从上述标记的信号不被单一类型的检测器区别。


5.一种利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在1个反应容器中与用于检测上述至少3个靶核酸序列的至少3个信号-产生机构一同培养上述试样，并利用单一类型的检测器检测所产生信号，借助相应的信号-产生机构分别检测上述至少3个靶核酸序列，上述至少3个靶核酸序列分别具有借助相应的上述信号-产生机构确定的不同检测温度，上述检测温度为不仅能够产生具有上述检测温度的靶核酸序列的信号且还能够产生针对具有高于上述检测温度的检测温度的靶核酸序列的信号的温度，由上述信号-产生机构产生的信号不被上述单一类型的检测器区别，通过检测温度分析检测上述至少3个靶核酸序列中的一部分靶核酸序列，在上述至少3个靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的检测温度以及高于上述检测温度的1个以上的检测温度均进行上述检测；
步骤(b)，为了在上述至少3个靶核酸序列中确定除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在，在规定范围的温度下，对上述步骤(a)的培养结果物进行解链分析；以及
步骤(c)，(i)根据在上述步骤(a)中检测出的信号确定上述靶核酸序列中的上述一部分靶核酸序列的存在，当在上述至少3个靶核酸序列的上述一部分靶核酸序列中确定具有特定检测温度的靶核酸序列的存在时，则根据在高于上述特定检测温度的1个以上的检测温度下检测出的信号以及在上述特定检测温度下检测出的信号之间的差异确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，在上述检测温度中上述特定检测温度为相对最高检测温度时，根据在上述特定检测温度下检测出的信号确定具有上述特定检测温度的靶核酸序列的存在，(ii)在上述步骤(b)中，根据解链分析的结果确定上述至少3个靶核酸序列中的除了上述一部分靶核酸序列之外的其他靶核酸序列的存在。


6.根据权利要求5所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，首先确定具有相对最高检测温度的靶核酸序列的存在后，以按降序排列依次确定具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在的方式进行上述步骤(c)。


7.根据权利要求5所述的利用检测温度及解链分析检测试样内至少3个靶核酸序列的方法，其特征在于，针对各个上述靶核酸序列的信号-产生机构为以依赖于二聚物形成的方式产...

【专利技术属性】
技术研发人员：千钟润，李荣祚，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR