通用发夹引物制造技术

本发明专利技术涉及靶核酸扩增的方法及其在测序方法或其他下游应用诸如基因分型或克隆中的用途。更具体地，该方法涉及通过使用通用发夹引物扩增靶核酸的方法。

Universal hairpin primer

The invention relates to a method of target nucleic acid amplification and its use in sequencing method or other downstream applications such as gene typing or cloning. More specifically, the method relates to a method of amplifying a target nucleic acid by using a universal hairpin primer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用发夹引物相关申请的交叉引用本申请要求于2017年3月24日提交的美国临时申请号62/476,108的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。以ASCII文本文件提交的“序列表”、表格、或计算机程序表附页的引用将2018年3月19日于机器型号IBM-PC，MS-Windows操作系统创建的1,028字节的文件097505-113810PC-1079936_SequenceListing.txt中所记载的序列表全文纳入本文用于所有目的。
技术介绍
扩增感兴趣的靶核酸有许多方法。这些方法中的一些，诸如PCR和其衍生方法，广泛应用于分子生物学领域。PCR是一种敏感且特异性的试验，其能够在大量非靶核酸材料中检测微量靶核酸序列。例如，已知基于PCR的方法，用于检测少量DNA诸如来自孕妇血浆样品的无细胞DNA以筛选胎儿非整倍性或检测癌症患者血液样品中的循环肿瘤DNA(ctDNA)，参见例如，美国专利申请号20150147815、20150087535和20160138112，以及美国专利号9,334,541和9,499,870，其公开通过引用纳入本文。PCR原理的持续扩张使得许多公司投入大量资源来简化核酸文库的制备程序和扩增过程，例如，在水性溶液、微滴、乳液和基于固相的核酸扩增中进行反应(例如，亿明达有限公司(IlluminaInc.)，离子激流公司(IonTorrent)，454生物科学公司(454LifeSciences)和太平洋生物科学公司(PacificBiosciences))。核酸扩增方法的进一步改进导致多重核酸扩增反应的发展，能够在单个反应混合物中扩增数百或数千种核酸靶标，参见例如，美国专利申请号20160369333和美国专利号8,673,560和8,728,728，其公开通过引用纳入本文。相应地，设计引物及其在核酸扩增反应中的功能对于预防和/或降低错误引发和/或失败引发事件的可能性，多重核酸扩增反应的开发以及需要较少优化单个引物浓度而言是十分重要的，因为核酸扩增反应的参数变得更加协调。核酸扩增反应引物设计的一些参数在本领域中充分记载，诸如百分比GC含量，引物长度，退火和解链温度，5’端稳定性和3’端特异性(Dieffenbach等，述于《PCR方法和应用》(PCRMethodsandApplications)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratory)，3:S30-S37(1993))。引物设计的另一考虑因素是二级结构的存在，如发夹(茎环)或引物二聚体。通过限制引物引发的可用性及其结合感兴趣的靶核酸的能力，发夹可以大幅度地降低PCR反应的效率。因为存在于引物二级结构内的互补核酸序列，这些二级结构导致失败、不成比例或无效率的核酸扩增。存在这样的多种算法，其允许用户输入潜在的引物设计以确定二级结构的存在(例如，NCBIBLAST-Primer软件、Primer3Plus软件)。通常，舍弃具有显著二级结构的引物，倾向于缺少二级结构的类似引物，以使核酸扩增反应的效率最大化(参见例如，Singh等,MolBiol.,1(3):67-69(2000))。因此，我们提供了改进的方法、试剂盒和反应混合物，用于扩增核酸。专利技术概述本文提供用于核酸扩增的方法、试剂盒和反应混合物。该方法包括使用第一靶引物对和通用引物对，所述第一靶引物对包含一种或两种靶特异性发夹引物，所述靶特异性发夹引物具有：(i)3'单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时，(ii)5'区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹；所述通用引物对包含一种或两种这样的发夹引物，所述发夹引物具有所述5'区并且没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定。在一些实施方式中，在低于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，第一靶引物对的3'单链靶特异性区是单链。在一些实施方式中，在高于、低于或等于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，3'单链靶特异性区是单链。在一些实施方式中，该方法包括：(1)将第一靶核酸与(a)第一靶引物对和(b)通用引物对混合，所述第一靶引物对包含一种或两种第一靶特异性发夹引物，所述发夹引物具有(i)3’单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时和(ii)5’区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹，其中所述5’区包含通用衔接子序列，所述通用引物对包含一种或两种通用发夹引物，所述通用发夹引物(i)具有所述5’区并且(ii)没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定；(2)以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第一靶引物对的至少一种第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区退火至所述第一靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一扩增子；(3)将所述第一扩增子变性成两条核酸链；(4)以高于发夹Tm温度的温度将所述一种或多种通用发夹引物退火至所述第一扩增子中一条链的通用衔接子序列；(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二扩增子，从而扩增所述第一靶核酸。在一些实施方式中，在低于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，3'单链靶特异性区是单链。在一些实施方式中，在高于、低于或等于形成发夹的5'区Tm温度的温度时，3'单链靶特异性区是单链。在一些实施方式中，该方法还包括对第二扩增子进行测序或纯化。在一实施方式中，纯化第二扩增子可以包括由未扩增的核酸材料中纯化第二扩增子。在一实施方式中，纯化第二扩增子可以包括由第二靶核酸的第二扩增子分离或区分第一靶核酸的第二扩增子。在一些实施方式中，测序可以包括大规模平行下一代测序(NGS)。在一些实施方式中，本文所公开的核酸扩增的方法包括不对称或巢式PCR。在一些实施方式中，本文所公开的方法包括核酸扩增的实时分析。在一些实施方式中，本文公开的方法包括桥式PCR或簇扩增。在一实施方式中，靶核酸扩增在微滴中进行。在另一实施方式中，稀释靶核酸，从而将来自靶核酸的单一基因组靶标(平均)划分到单个微滴中。在一些实施方式中，将靶核酸、第一靶引物对和通用引物对划分到微滴中。在一些实施方式中，前述段落中所述方法的第一靶引物对包含两种靶特异性发夹引物。在一些实施方式中，该方法包括重复多次步骤(2)和(3)。在一些实施方式中，步骤(2)和(3)重复5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次。在一些实施方式中，步骤(2)和(3)重复5-15个循环，而步骤(4)和(5)重复5-30个循环。在一实施方式中，步骤(4)和(5)重复5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30次。在一些实施方式中，第一靶引物对在步骤(4)之前耗尽。在一些实施方式中，第一靶引物对不与标签连接或者包括标签。在一些实施方式中，前述段落中所述方法的通用引物对包含两种通用发夹引物。在一些实施方式中，步骤(1)的通用引物对以大于第一靶引物对量的量存在。在一些实施方式中，步骤(1)的通用引物对包含至少一种与标签连接的通用发夹引物，从而在扩增过程中使标签纳入第二扩增子。在一实施方式中，标签位于通用发夹引物的5’端。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶核酸扩增的方法，其包括：(1)将第一靶核酸与下述物质混合：(a)第一靶引物对，所述第一靶引物对包含一种或两种第一靶特异性发夹引物，所述发夹引物具有：(i)3’单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时，和(ii)5’区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹，其中所述5’区包含通用衔接子序列，和(b)通用引物对，所述通用引物对包含一种或两种通用发夹引物，所述通用发夹引物：(i)具有所述5’区，并且(ii)没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定；(2)以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第一靶引物对的至少一种第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区退火至所述第一靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一扩增子；(3)将所述第一扩增子变性成两条核酸链；(4)以高于所述Tm温度的温度将所述一种或两种通用发夹引物退火至所述第一扩增子中一条链的通用衔接子序列；(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二扩增子，从而扩增所述第一靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.24 US 62/476,1081.一种靶核酸扩增的方法，其包括：(1)将第一靶核酸与下述物质混合：(a)第一靶引物对，所述第一靶引物对包含一种或两种第一靶特异性发夹引物，所述发夹引物具有：(i)3’单链靶特异性区，当其处于或低于Tm温度时，和(ii)5’区，其在低于Tm温度时形成发夹而在高于Tm温度时不形成所述发夹，其中所述5’区包含通用衔接子序列，和(b)通用引物对，所述通用引物对包含一种或两种通用发夹引物，所述通用发夹引物：(i)具有所述5’区，并且(ii)没有单链3'端，据在低于Tm温度时所确定；(2)以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第一靶引物对的至少一种第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区退火至所述第一靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一扩增子；(3)将所述第一扩增子变性成两条核酸链；(4)以高于所述Tm温度的温度将所述一种或两种通用发夹引物退火至所述第一扩增子中一条链的通用衔接子序列；(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二扩增子，从而扩增所述第一靶核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一靶引物对包含两种靶特异性发夹引物或者所述通用引物对包含两种通用发夹引物。3.如权利要求1所述的方法，其中，重复多次步骤(2)和(3)。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述第一靶引物对在步骤(4)之前耗尽。5.如权利要求1所述的方法，其中，至少一种通用发夹引物与标签连接，从而使所述标签纳入所述第二扩增子，或者所述第一靶引物对不与标签连接。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述Tm温度比所述第一靶特异性发夹引物的Tm温度低至少2℃。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述混合进一步包括混合第二靶引物对，所述第二靶引物对包含一种或两种第二靶特异性发夹引物，所述第二发夹引物具有：(i)3’单链靶特异性区，其不同于所述第一靶特异性发夹引物的3’单链靶特异性区，和(ii)所述5’区；步骤(2)包括以处于或低于Tm温度的温度将来自所述第二靶引物对的至少一种第二靶特异性发夹引物退火至第二靶核酸，并用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述第二靶特异性发夹引物，以形成包含一条或两条通用衔接子序列的第一延伸产物，步骤(3)包括将所述第一延伸产物变性成两条核酸链；(4)以高于所述Tm温度的温度将所述一种或两种通用发夹引物退火至所述第一延伸产物中一条链的通用衔接子序列；(5)用聚合酶以模板依赖性方式延伸所述一种或两种通用发夹引物，以形成第二延伸产物，从而扩增所述第二靶核酸。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述第二靶引物对包含两种靶特异性发夹引物或者所述一种或两种通用发夹引物包含两种通用发夹引物。9.如权利要求7所述的方法，其中，所述混合还包括混合1-10、1-20、1-30、1-40或1-50种其他靶引物对，其中所述其他靶引物对包含一种或两种靶特异性发夹引物，所述靶特异性发夹引物具有：...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·拉孜，P·玛丽，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US