一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器制造技术

本发明专利技术涉及重金属铅离子检测的电化学传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。其特征在于：首先合成得到NG‑PTCA纳米材料，然后将HAuCl4通过Thi还原为金纳米粒子(AuNPs)并修饰在NG‑PTCA纳米材料，得到NG‑PTCA‑Thi‑Au纳米复合物，再将发夹状DNA信号探针与该复合材料混合，制得生物信号探针；构建传感器前，在Pb

A biosensor for heavy metal lead detection based on double signal amplification

The invention relates to a preparation method and application of an electrochemical sensor for heavy metal lead ion detection, belonging to the technical field of electrochemical detection. It is characterized in that: firstly, ng \u2011 PTCA nanomaterials are synthesized, then HAuCl4 is reduced to gold nanoparticles (AuNPs) through thi and modified in ng \u2011 PTCA nanomaterials, then ng \u2011 PTCA \u2011 thi \u2011 Au nanocomposites are obtained, and then hairpin like DNA signal probes are mixed with the composite materials to produce biological signal probes; before sensor construction, Pb

【技术实现步骤摘要】
一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器
：本专利技术涉及一种在环境中定量检测重金属铅离子的电化学传感器的制备方法及应用，尤其是基于催化发夹组装和修饰硫堇和金纳米粒子的苝-3，4，9，10-四甲酸分散的氮掺杂石墨烯被作为信号探针制备的双信号放大生物传感器，并利用8-17DNAzyme特异催化功能用于检测重金属铅离子，属于电化学检测领域。
技术介绍
：铅离子(Pb2+)被认为是一种重金属污染物，对人类和生态系统的可持续性构成威胁。它可以在体内积聚，并引起各种疾病，包括神经，生殖，心血管等方面的疾病。即使低剂量的Pb2+也具有强烈的毒性，影响婴儿和儿童的成长，智力发育。美国环境保护署(EPA)已将饮用水中Pb2+的最大污染水平降至72.4nM。因此，监测低浓度Pb2+具有重要意义。传统检测Pb2+的方法包括原子吸收光谱法(AAS)，原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，它们已被广泛用于分析和检测Pb2+。然而，这些方法复杂的设备或样品制备限制了它的广泛应用。因此，有必要开发一种方便且高度灵敏检测和分析Pb2+的方法。近年来，电化学方法由于灵敏度高，选择性好，成本低，响应时间短而备受关注。然而，许多研究致力开发高灵敏度的电化学传感器。比如基于催化发夹组装(CHA)的信号放大策略由于其操作简单和无酶策略被广泛应用。在CHA过程中，具有发夹捕获探针互补序列的单链DNA(ssDNA)通过打开和杂交两个发夹探针触发此过程，同时释放ssDNA以启动下一个循环。在这种情况下，CHA通过循环ssDNA并有效放大电流响应来增强灵敏度。此外，各种具有优异性能的纳米材料也已应用于信号放大策略，以提高传感器的性能。本课题组开发了结合前两种提到的放大策略，实现双信号放大，有效提高传感器的灵敏度。氮掺杂石墨烯(NG)是在石墨烯中掺杂氮，被认为是具有良好导电性和高比表面积的候选材料，可用作纳米材料负载的平台。然而，NG分散性差并易聚集，这限制了它在生物传感器中的应用。报道过的提高NG分散性的文献是通过添加NaOH调节NG溶液的pH至碱性，但这可能会破坏其结构及降低电子传导性。为了避免以上问题，本实验使用苝-3，4，9，10-四甲酸(PTCA)，它是一种具有丰富多羧酸位点的水溶性苝衍生物，具有大的比表面积，优异的稳定性和理想的导电性。通过π-π堆积和疏水相互作用修饰NG来提高其分散性，且不破坏NG的共轭π-体系。从而使得到的NG-PTCA显示出高分散性和优异的导电性。此外，NG-PTCA的活性位点和有效区域也增加，可以通过π-π堆积充分负载电活性物质硫堇(Thi)，同时有利于金纳米颗粒(AuNPs)的生长。Thi作为电活性材料用于后续的电化学检测，也作为还原剂用于还原HAuCl4为AuNPs。本课题组成功设计了NG-PTCA-Thi-Au纳米复合材料并通过Au-S共价键组装发夹信号探针(H2)，获得新的NG-PTCA-Thi-Au-H2纳米复合材料(示踪标记)，并应用于电化学检测中的信号产生和放大。脱氧核酶(DNAzyme)是通过体外选择的各种催化DNA序列，其对特定底物具有高催化活性。目前发现的大部分DNAzyme都以金属离子为辅因子，且其活性具有RNA切割作用的金属离子特异性。由于其特异性，已经制造了以Mg2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+等作为辅因子的电化学传感器。8-17DNAzyme是一种依赖Pb2+的脱氧核酶，它具有Pb2+特异性切割位点，由底物链(S)和催化链(C)组成，被认为是Pb2+的识别元件，已被广泛用于基于各种信号转导策略来检测Pb2+。一般来说，一些策略将8-17DNAzyme固定在电极表面或用荧光基团或氧化还原活性基团修饰它来检测Pb2+，这可能会限制检测灵敏度或破坏DNAzyme的催化活性。因此，本文将8-17DNAzyme在体外进行切割，其显着优点是可以消除其他修饰材料或固定在电极表面对8-17DNAzyme产生的不必要干扰。从而最大程度地保持了8-17DNAzyme的活性。在体外切割后，引入8-17DNAzyme切割的底物片段(S1)作为ssDNA开启双重信号放大策略。基于上述策略，本实验设计了一种基于NG-PTCA-Thi-Au联合CHA双信号放大策略的高特异性、高灵敏度的信号生物传感器，用于检测Pb2+。总之，在Pb2+存在下，8-17DNAzyme的底物链S在切割位点被切割成两个片段，被切割片段S1可以触发CHA过程。在CHA过程中，S1通过杂交反应打开发夹捕获探针(H1)，暴露H1的隐藏序列，其打开H2以形成H1-S1-H2复合物杂交。然后，该过程释放S1以启动下一个循环并实现信号放大。因此，由于H1和H2的杂交，许多示踪标记锚定在电极上，进一步从示踪标记上的Thi产生显着放大的电化学信号。因此，实现了基于NG-PTCA-Thi-Au和CHA的双信号放大以检测痕量的Pb2+。更重要的是，这种制备的Pb2+传感器在检测实际样品时表现出极佳的灵敏度和特异性，表明应用于环境水样中检测Pb2+的潜力。本项目建立了一种新型分析方法检测铅离子，为铅离子检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅离子的监测提供新思路和新技术平台。
技术实现思路
：1.本专利技术的目的是构建基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器，为铅离子检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅离子的监测提供新思路和新技术平台。其特征包括以下步骤：(1)8-17DNAzyme的制备与切割(2)苝-3，4，9，10-四甲酸分散的氮掺杂石墨烯(NG-PTCA)被修饰硫堇(Thi)和金纳米粒子(AuNPs)后组装发夹信号DNA所形成的的信号检测探针(NG-PTCA-Thi-Au-H2)的制备；(3)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。2.本专利技术所述8-17DNAzyme制备与切割的过程具体包括以下步骤，其特征包括以下步骤：(1)8-17DNAzyme的制备：首先将底物链(2μM)在95℃水浴中加热5分钟，然后缓慢冷却至室温。接下来，将相同体积的催化链(2μM)与底物链混合并在65℃水浴中孵育10分钟。使水浴缓慢冷却至室温以确保其杂交形成1μM8-17DNAzyme。(2)8-17DNAzyme的切割：将不同浓度的Pb2+加入到5μL8-17DNAzyme中，并在37℃培养箱中反应40分钟，8-17DNAzyme的催化中心可以捕获Pb2+，并与8-17DNAzyme碱基配位形成8-17DNAzyme-Pb2+复合物结构。然后，8-17DNAzyme在rA切割位点有效地催化了切割反应，将底物链S切割成两个片段。被切割的片段(S1)与H1的部分序列互补，并能基于碱基互补配对进行杂交。3.本专利技术所述苝-3，4，9，10-四甲酸分散的氮掺杂石墨烯(NG-PTCA)被修饰硫堇(Thi)和金纳米粒子(AuNPs)后组装发夹信号DNA所形成的的信号检测探针(NG-PTCA-Thi-Au-H2)的制备过程具体包括以下步骤，其特征包括以下步骤：(1)PTCA纳米材料的制备：首先将500mgPTCDA溶在50ml1MNaOH水溶液中，然后在80℃下水解PTCDA1小时。当黄绿色溶液中出现红色沉淀时，将1M盐酸缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器，其特征在于包括以下步骤：(1)8‑17 DNAzyme的制备与切割(2)苝‑3，4，9，10‑四甲酸分散的氮掺杂石墨烯(NG‑PTCA)被修饰硫堇(Thi)和金纳米粒子(AuNPs)后组装发夹信号DNA所形成的的信号检测探针(NG‑PTCA‑Thi‑Au‑H2)的制备；(3)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器，其特征在于包括以下步骤：(1)8-17DNAzyme的制备与切割(2)苝-3，4，9，10-四甲酸分散的氮掺杂石墨烯(NG-PTCA)被修饰硫堇(Thi)和金纳米粒子(AuNPs)后组装发夹信号DNA所形成的的信号检测探针(NG-PTCA-Thi-Au-H2)的制备；(3)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述8-17DNAzyme制备与切割的过程，其特征包括以下步骤：(1)8-17DNAzyme的制备：首先将底物链(2μM)在95℃水浴中加热5分钟，然后缓慢冷却至室温。接下来，将相同体积的催化链(2μM)与底物链混合并在65℃水浴中孵育10分钟。使水浴缓慢冷却至室温以确保其杂交形成1μM8-17DNAzyme。(2)8-17DNAzyme的切割：将不同浓度的Pb2+加入到5μL8-17DNAzyme中，并在37℃培养箱中反应40分钟，8-17DNAzyme的催化中心可以捕获Pb2+，并与8-17DNAzyme碱基配位形成8-17DNAzyme-Pb2+复合物结构。然后，8-17DNAzyme在rA切割位点有效地催化了切割反应，将底物链S切割成两个片段。被切割的片段(S1)与H1的部分序列互补，并能基于碱基互补配对进行杂交。3.根据权利要求1所述NG-PTCA-Thi-Au-H2复合物的制备过程，其特征包括以下步骤：(1)PTCA纳米材料的制备：首先将500mgPTCDA溶在50ml1MNaOH水溶液中，然后在80℃下水解PTCDA1小时。当黄绿色溶液中出现红色沉淀时，将1M盐酸缓慢滴加到上述混合物中并最终保持pH为弱酸性。随后，通过12000rpm离心收集红色沉淀并利用冷冻干燥器干燥收集，得到产物PTCA。(2)NG-PTCA纳米复合材料的制备：首先将10mgNG与2mgPTCA溶在10mL超纯水中并超声2小时。然后，将溶液在环境温度下连续搅拌5小时并过夜。最后，将混合物离心并用超纯水洗涤三次。在60℃下真空干燥后收集，得到产物NG-PTCA。(3)NG-PTCA-Thi-Au纳米复合物的制备：为了一步合成NG-PTCA-Thi-AuNPs纳米复合材料，NG-PTCA溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：何俊琳，于超，马一丹，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50