一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用，包括以下步骤：（1）基础层析介质Sephadex G‑75活化后，分别与1，3‑二氨基‑2‑羟基丙烷、三聚氯嗪、2‑氨基并噻唑反应，合成玻璃酸酶特异性层析介质；（2）利用合成的特异性层析介质纯化玻璃酸酶粗品。通过Sephadex G‑75为骨架，三聚氯嗪为间臂连接的1，3‑二氨基‑2‑羟基丙烷和2‑氨基并噻唑为配体，利用分子间的相互作用力，特异性吸附玻璃酸酶，变换缓冲液条件，分别洗脱杂质蛋白和玻璃酸酶。本发明专利技术能够高效率、大规模生产玻璃酸酶，玻璃酸酶回收率达到86.6%，玻璃酸酶活性高达4500 IU/mg。

Synthesis and application of a hyaluronidase specific chromatography medium

The invention relates to the synthesis and application of hyaluronidase specific chromatography medium, which comprises the following steps: (1) after the activation of Sephadex \u2011 g \u2011 75, the basic chromatography medium reacts with 1,3 \u2011 diamino \u2011 2 \u2011 hydroxypropane, trichlorazine and 2 \u2011 amino-p-thiazole respectively to synthesize hyaluronidase specific chromatography medium; (2) purification of hyaluronidase crude by using the synthesized specific chromatography medium \u3002 Using sephadex-G-75 as the skeleton, trichlorazine as the 1,3-diamino-2-hydroxypropane and 2-amino-2-thiazole as the ligands, using the intermolecular interaction, specifically adsorbing hyaluronidase, changing the buffer conditions, eluting the impurity protein and hyaluronidase respectively. The invention can produce hyaluronidase in high efficiency and large scale, the recovery rate of hyaluronidase is 86.6%, and the activity of hyaluronidase is 4500 IU / mg.

【技术实现步骤摘要】
一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及的是一种生物医药
的纯化方法。特别是一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用。
技术介绍
玻璃酸酶，又称透明质酸酶，是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷键水解。它在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颌下腺、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。临床用于局部注射，可加速皮下、肌内注射药液的吸收，促进局麻药的浸润，促进手术及创伤后局部水肿或血肿的扩散，也用于肠粘连。国内外对于玻璃酸酶的研究主要集中在各种毒液，已从多种毒液中分离纯化出玻璃酸酶。哺乳动物的睾丸中玻璃酸酶含量很高，但对于哺乳动物中玻璃酸酶的报道较少，且几乎都是早期报道。现有技术“CN201210598018.7一种玻璃酸酶的提取方法”选用猪睾丸为原材料，采用高速离心和过滤提取方法，对玻璃酸酶进行分离和纯化，使玻璃酸酶效价可以达到340IU/mg。“CN201310047266.7牛或羊玻璃酸酶的生产方法”通过原料预处理，匀浆，超声波浸提，搅拌提取，硫酸铵除杂，硫酸铵沉淀，透析，阳离子交换色谱层析，凝胶过滤色谱层析，真空冷冻干燥等工艺步骤，得到的玻璃酸酶效价≥1500单位。“CN201110176365.6一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法”提供了一种睾丸提取液经葡聚糖凝胶SephadexG-75层析，冷冻干燥，得到玻璃酸酶纯品。该方法所得玻璃酸酶活性达700U/mg以上，收率达9.2%。现有技术中，方法包括离心过滤、色谱层析、凝胶过滤层析等。凝胶过滤层析利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据分子量的差别进行分离，是精细纯化所采用的理想技术。“CN201310369641.X玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法”提供了一种利用基础层析材料制备玻璃酸酶亲和性材料，通过其对玻璃酸酶的专一性吸附，达到纯化的目的。该法所得玻璃酸酶活性最高达1800IU/mg。现有技术还是存在收率低、效价低的缺点，因此，有必要开发一种效率高、效价高的玻璃酸酶层析介质及其应用方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用，使其克服玻璃酸酶大规模纯化中的缺点，在大规模分离纯化时步骤少、成本低、效率高，利用特异性层析介质中与玻璃酸酶间的相互作用力，可快速、简便、低成本、大批量纯化玻璃酸酶。因此，本专利技术的目的在于提供一种玻璃酸酶的特异性层析介质；本专利技术的另一个目的在于提供一种玻璃酸酶特异性层析介质的应用方法。本专利技术通过以下技术方案实现，以基础层析介质葡聚糖凝胶（SephadexG75）作为骨架合成特异性层析介质，以合成的特异性层析介质作为分离材料纯化玻璃酸酶。本专利技术包括以下步骤：步骤一、特异性层析介质的合成：（1）基础层析介质SephadexG-75加入活化缓冲液，40℃搅拌2.5h，10倍体积纯化水洗涤后，抽干呈湿饼状；其中活化缓冲液的组成为浓度为0.5M的NaOH溶液，体积分数为10%的二甲亚砜，体积分数为6%环氧氯丙烷。（2）加入1，3-二氨基-2-羟基丙烷的水溶液，在60℃搅拌20h，10倍体积纯化水洗涤后，抽干呈湿饼状；（3）加入三聚氯嗪的水-丙酮溶液，调节pH为7.5，4℃搅拌1h，10倍体积纯化水洗涤后，抽干呈湿饼状；（4）加入2-氨基并噻唑水溶液，40℃搅拌12h，维持pH为9~10，洗涤后抽干呈湿饼状即可。其中（4）中2-氨基苯并噻唑事先用少量二甲亚砜溶解，再混入水中。步骤二、玻璃酸酶特异性层析介质纯化玻璃酸酶（1）取玻璃酸酶亲和层析介质装柱，用浓度为0.1M的醋酸钠缓冲液（pH7.0）冲洗平衡亲和层析介质。（2）取玻璃酸酶粗品，用水溶解，搅拌溶解2小时，离心，取上清液，用10K超滤器浓缩。其中玻璃酸酶粗品来源于羊睾丸。（3）将上述（2）的浓缩液过上述（1）经过平衡的玻璃酸酶亲和层析介质吸附，然后用浓度为0.02M的醋酸钠缓冲液（pH7.0）洗涤杂质蛋白。（4）再用0.1M醋酸钠﹣0.6M氯化钠溶液（pH7.0）洗脱，收集洗脱流出蛋白高峰段。所述玻璃酸酶特异性层析介质，以基础层析介质SephadexG-75作为骨架，利用三聚氯嗪作为间臂连接1，3-二氨基-2-羟基丙烷和2-氨基苯并噻唑作为配体，二者以共价键结合，形成特异性层析介质。本专利技术克服了玻璃酸酶纯化技术中的缺点，使玻璃酸酶纯化达到步骤少，成本低，收率高、效价高的目的。利用SephadexG75合成对玻璃酸酶专一的特异性层析介质，其结构如说明书附图1所示。该介质可快速、准确、简便、低成本、大批量纯化玻璃酸酶。玻璃酸酶回收率达到86.6%，酶活性超过4500IU/mg。附图说明图1完整配体在透明质酸酶活性口袋中与周边氨基酸残基的相互作用其中（1）为常规氢键；（2）为π-π叠加；（3）为碳氢键；（4）π-πT形相互作用；（5）π-阴离子；（6）π-烷基图2完整配体在玻璃酸酶活性口袋中的结合位置。具体实施方式实施例一步骤一、特异性层析介质的合成基础层析介质SephadexG75的活化：取SephadexG752000g，用10倍体积的纯化水洗涤，抽干成湿饼状；加2000ml活化缓冲液，40℃搅拌2.5h，然后倒入漏斗中，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。其中活化缓冲液的组成为浓度为0.5M的NaOH溶液，体积分数为10%的二甲亚砜，体积分数为6%环氧氯丙烷。（2）活化的SephadexG75介质加2000ml含5%的1，3-二氨基-2-羟基丙烷-水溶液，60℃搅拌20h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。（3）加2000ml浓度为0.1M三聚氯嗪的水﹣丙酮溶液，用浓度为0.1M氢氧化钠调体系pH为7.5，4℃冰浴搅拌1h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。（4）加2000ml浓度为0.15M的2-氨基苯并噻唑-水溶液，40℃搅拌12h，pH维持至9～10，用纯化水清洗，抽干成湿饼状即可。其中（4）中2-氨基苯并噻唑事先用少量二甲亚砜溶解，再混入水中。步骤二、玻璃酸酶特异性层析介质纯化玻璃酸酶（1）取玻璃酸酶亲和层析介质2000ml，装柱，用8L浓度为0.1M的醋酸钠缓冲液（pH7.0）冲洗平衡亲和层析介质。（2）取4亿单位玻璃酸酶粗品，用20倍的水分两次溶解，每次搅拌溶解2小时，离心，取上清液，用10K超滤器浓缩至体积约3L。（3）将上述（2）的浓缩液过上述（1）经过平衡的玻璃酸酶亲和层析介质吸附，然后用4～6L浓度为0.02M的醋酸钠缓冲液（pH7.0）洗涤杂质蛋白。（4）再用0.1M醋酸钠﹣0.6M氯化钠溶液（pH7.0）洗脱，收集洗脱流出蛋白高峰段。检测效价为3.46亿单位，收率为86.6%，酶活性超过4500IU/mg。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玻璃酸酶特异性层析介质，其特征在于，所述玻璃酸酶特异性层析介质由配体和层析介质连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种玻璃酸酶特异性层析介质，其特征在于，所述玻璃酸酶特异性层析介质由配体和层析介质连接而成。2.根据权利要求1所述的一种玻璃酸酶特异性层析介质，其特征在于，所述配体为2-氨基苯并噻唑和1，3-二氨基-2-羟基丙烷，所述层析介质为SephadexG-75。3.根据权利要求1所述的一种玻璃酸酶特异性层析介质，基础层析介质SephadexG-75作为骨架，利用三聚氯嗪作为间臂连接1，3-二氨基-2-羟基丙烷和2-氨基苯并噻唑作为配体，二者以共价键结合，形成特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兰花，杨益辉，陈康，陈备战，
申请(专利权)人：南昌市万华生化制品有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36