一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用制造技术

本发明专利技术涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用。本发明专利技术的复合菌剂，是有保藏编号为CCTCC NO：M2019654的干酪乳杆菌和植物乳杆菌、拟干酪乳杆菌混配或混合发酵而成。本发明专利技术中的复合菌剂发酵上清液，能降低鲤疱疹病毒II型（CyHV‑2）对宿主细胞的感染活性，抑制CyHV‑2病毒入侵对细胞的感染，对细胞无毒副作用，且复合菌剂的抑制效果比单独使用干酪乳杆菌YFI‑5的效果要好。饲料添加复合菌剂菌体可有效降低鲫鱼感染CyHV‑2的死亡率，可以用于预防和治疗鲫造血器官坏死症。

A lactic acid bacteria compound and its application in the treatment of carp herpesvirus type II

The invention relates to the technical field of aquatic antiviral microecological preparation, in particular to a lactic acid bacteria compound bacterial agent and its application in anti carp herpesvirus type II. The compound bacterial agent of the invention is prepared by mixing or mixed fermentation of Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei with the preservation number of CCTCC No: m2019654. The compound bacterial fermentation supernatant of the invention can reduce the infection activity of Cyprinus carpio herpesvirus type II (cyhv \u2011 2) on the host cell, inhibit the infection of cyhv \u2011 2 virus invasion on the cell, and has no side effect on the cell, and the inhibition effect of the compound bacterial is better than that of Lactobacillus casei yfi \u2011 5 alone. The death rate of cyhv \u2011 2 infection in Carassius auratus can be effectively reduced by adding compound bacteria to the feed, which can be used to prevent and treat the hemopoietic organ necrosis of Carassius auratus.

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用
本专利技术涉及水产抗病毒微生态制剂
，具体涉及一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用。
技术介绍
鲫是我国淡水养殖鱼类重要品种之一，其年总产量现已超过300万吨，在淡水养殖中占据十分重要的地位。近年来，我国鲫鱼连年发生导致养殖异育银鲫暴发性死亡的出血性疾病，造成重大经济损失。电镜观察患病鲫鱼脾肾组织的超薄切片，发现大量典型疱疹病毒样颗粒，进一步研究确认该病为鲫造血器官坏死症(CrucianCarpHematopoieticNecrosis)，其病原为鲤疱疹病毒II型(Cyprinidherpesvirus2，CyHV-2)。感染CyHV-2的异育银鲫典型临床症状主要表现为食欲减退，离群独游，呼吸频率加快，活力差，沉在水底。患病鱼体表、鳍基和鳃出血，腹部膨胀，眼球突出。鳃丝苍白，肌肉有点状出血，脾和肾发红肿胀，鳔出现点状出血，肝肿大、出血，肠道空。鲫造血器官坏死症是一种高传染性疾病，但其传播范围有限，研究表明，目前该病只对金鱼、鲫鱼及其普通变种有感染性。研究者发现金鱼和鲤鱼的杂交体也是CyHV-2的易感体，且各个规格的鱼体均可感染。水产养殖过程中如何预防和治疗病害的发生长久以来都是困扰水产养殖业发展的一个重要问题。当前，用于防治水产养殖动物病害的方法主要有药物防治和疫苗免疫两种。然而药物防治引起的副作用、药物残留、耐药性以及水体污染等一系列问题逐渐受到社会各界的普遍重视，除此之外，药物防治针对病毒性疾病的治疗效果不十分明显；受敏感细胞系缺乏、病毒变异、免疫方式不便的影响，渔用疫苗的发展受到影响。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。近年来，诸多的研究者认为水产养殖过程中乳酸菌在一定程度上有望成为药物的替代品用于各种疾病的预防与治疗，为病害防控方案提供新策略。杨勇等(2006)证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，抑制效率在90％以上。Gildberg等(1998)用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。已有资料显示乳酸菌不仅有抗菌活性，还具有抗病毒活性。Ang等(2016)发现干酪乳杆菌能够通过抑制柯萨奇病毒的侵染来防治手足口病。目前，乳酸菌在水产养殖过程中被广泛应用，但关于乳酸菌抑制水产病原菌和病毒的研究还较少。本专利技术首次发现一种可以对鲤疱疹病毒2型具有抑制作用的乳酸菌复合菌剂，为该病毒的防治提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种乳酸菌复合菌剂，该复合菌剂包括干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌YFI-5的保藏编号为：CCTCCNO:M2019654。本专利技术的灵已给目的在于提供了一种乳酸菌复合菌剂的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：水产养殖区域池塘水样品中分离得到一株可抗鲤疱疹病毒II型的乳酸菌，命名为YFI-5，该菌株的保藏编号为CCTCCNO:M2019654，将该菌株与植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌复配后，可获得乳酸菌复合菌剂；来自商业渠道的植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌均能完成本专利技术。以上所述的乳酸菌复合菌剂，可直接将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌按照有效菌浓度为1.5-3：0.5-2:1-2混配而成，或是将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌的种子液，按照有效菌浓度为1.5-3：0.5-2:1-2混合后，混合发酵而成。乳酸菌复合菌剂的应用，包括利用乳酸菌复合菌剂制备成治疗或预防鲫造血器官坏死症药物，或制备成治疗或预防由鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)感染引起的疾病的药物，或是制备成鲤疱疹病毒II型抗病毒剂，或是制备成水产动物饲料添加剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本干酪乳杆菌YFI-5，配合为主的复合菌剂进行抗鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)感染，干酪乳杆菌YFI-5作为潜在的抗病毒微生态制剂与传统的抗病毒化学药物相比较具有如下优点：1、无毒副作用、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全。2、具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点3、可以通过口服的方式进入鱼体，抑制鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)的入侵和增殖，有效预防和治疗鲫造血器官坏死症。4、本专利技术的干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌以2：1：1的比例接种后发酵而成的复合菌剂对CyHV-2的抑制效果优于单株干酪乳杆菌YFI-5。附图说明图1为实施例4各组鲫鱼呼吸爆发力水平示意图。图2为实施例4各组鲫鱼血清溶菌酶水平示意图。图3为实施例4各组鲫鱼补体C3水平示意图。图4为实施例7各组鲫鱼呼吸爆发力水平示意图。图5为实施例7各组鲫鱼血清溶菌酶水平示意图。图6为实施例7各组鲫鱼补体C3水平示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：菌株分离鉴定1、干酪乳杆菌菌株分离干酪乳杆菌自水产养殖区域池塘水样品中分离得到，具体是用0.85％的无菌生理盐水将养殖池塘水样品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μL到BHI固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5～10min，使培养基表面菌液被充分吸收。最后将平板倒置，于恒温培养箱中30℃培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，最终获得了一株可抗鲤疱疹病毒II型的菌株，命名为YFI-5。2、YFI-5菌株的鉴定1)、生理生化特征取经LB固体培养基纯培养的菌株YFI-5，单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，30℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取Biolog细菌鉴定试剂盒IF-A接种液，将管外壁擦拭干净，置入Biolog浊度仪中调整其读数为100％T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％T-98％T之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μL体积转移至GENⅢ鉴定板中，然后将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。生理生化特征见表1。表1菌株YFI-5的生理生化特征2)菌株YFI-5的分子生物学鉴定扩增菌株16SrRNA的基因采用通用引物，16SF(27F)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16SR(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。菌株YFI-5经生理生化特征测定和16SrDNA序列同源性分析，鉴定为干酪乳杆菌。干酪乳杆菌YFI-5属于乳杆菌属，适合生长温度为37℃，经乳酸细菌培养基(MRS)培养48h后形成白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落；能发酵果糖、半乳糖和葡萄糖，不能利用蜜二糖、棉籽糖和木糖，不能分解精氨酸产氨。该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)YFI-5，保藏编号：CCTCCNO：M2019654，地址：中国武汉武汉大学。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳酸菌复合菌剂，包括干酪乳杆菌YFI‑5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌YFI‑5的保藏编号为：CCTCC NO: M2019654。

【技术特征摘要】
1.一种乳酸菌复合菌剂，包括干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌YFI-5的保藏编号为：CCTCCNO:M2019654。2.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备治疗或预防鲫造血器官坏死症药物中的应用。3.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备治疗或预防由鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）感染引起的疾病的药物中的应用。4.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备鲤疱疹病...

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，薛明洋，范玉顶，孟彦，刘文枝，江南，李逸群，曾令兵，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42