一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，该试剂盒包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：3.5～5.5ml/L，兔脑组织因子：3.5～5.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，所述荧光试剂含有以下成分：Glu‑Gly‑Arg‑AMC：0.5～1.0mmoL/L，二甲基亚砜:0.5～1.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，甘氨酸：30～50g/L，Proclin 300：0.05～0.15ml/L。与常规的试剂盒相比，本发明专利技术是首个动态全过程监测凝血酶生成能力的试剂盒，是最佳的止凝血全过程的描述者，是目前凝血功能实验的重要补充，更接近于临床表现，可作为重要的临床诊断工具在临床上推广应用。

A kit for dynamic monitoring of thrombin production

【技术实现步骤摘要】
一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒
本专利技术属于临床医学检测领域，具体涉及一种用于动态监测凝血酶生成能力，能对出凝血状况进行评价的试剂盒。
技术介绍
凝血酶(thrombin)是机体凝血系统中一类非常重要的丝氨酸蛋白酶，它由308个氨基酸残基组成，分子量为37kD；凝血酶由A链和B链残基组成，通过残基C1和C122之间的二硫键共价连接。B链是酶的活性位点和所有已知的活性表位的入口。位于分子后部的A链被认为是凝血酶原激活过程的附属物。然而，包括A链在内的凝血酶原分子的自然变异与严重出血有关。凝血酶在凝血系统中具有促凝和抗凝双重功能，在抗凝上，可使纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块，这对于血小板在伤口(病变)部位的固定和愈合过程的启动至关重要；在促凝上，凝血酶通过与完整内皮细胞的凝血调节蛋白结合，进而激活蛋白C发挥抗凝血作用。凝血酶-血栓调节蛋白相互作用降低了凝血酶裂解纤维蛋白原的能力，但增强了酶对活化蛋白C的亲和力。活化蛋白C使活化因子V(FVa)和VIII(FVIIIa)的活性形式失活，这是活化因子X(FXa)和IX(FIXa)的两个基本辅因子，从而降低凝血酶的生成。凝血酶是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，血栓与止血过程中发挥着重要的作用。所有血栓风险增加或出血风险增加的机理皆可引起凝血酶生成的增加或减少。凝血酶生成实验能够实时检测样本中凝血酶的生成过程及生产量，检测结果对临床疾病的早期诊断、病程发展、疗效的监测和机体出血凝血状况评估等都具有非常重要的意义。Glu-Gly-Arg-AMC是凝血酶特异性的荧光底物，可用于检测富血小板血浆(PRP)和乏血小板血浆(PPP)中凝血酶的生成。具有蛋白水解活性的凝血酶形成后，凝血酶的B链可以使荧光底物(Glu-Gly-Arg-AMC)裂解出荧光基团AMC(7-氨基-4甲基香豆素)，荧光基团AMC具备最大吸收波长：344nm和最大发射波长440nm的光学特征，并且荧光基团AMC的量与凝血酶的量具有相关性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种实时监测凝血酶生成能力，能对出凝血状况进行评价的试剂盒。该试剂盒与常规的试剂盒相比，是首个动态全过程监测凝血酶生成能力的试剂盒，是最佳的止凝血全过程的描述者，是目前凝血功能实验的重要补充，更接近于临床表现，可作为重要的临床诊断工具在临床上推广应用。该检测试剂盒还具有较好的稳定性和重复性。本专利技术提供的试剂盒包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：3.5～5.5ml/L，兔脑组织因子：3.5～5.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L；所述荧光试剂含有以下成分：Glu-Gly-Arg-AMC：0.5～1.0mmoL/L，二甲基亚砜:0.5～1.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，甘氨酸：30～50g/L，Proclin300：0.05～0.15ml/L。优选地，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：4.5ml/L，兔脑组织因子：4.5ml/L，牛血清白蛋白：5.0g/L。优选地，所述荧光试剂含有以下成分：Glu-Gly-Arg-AMC:1mmoL/L，二甲基亚砜：1ml/L，牛血清白蛋白：5g/L，甘氨酸：40g/L，Proclin300：0.1ml/L。优选地，所述反应缓冲液含有以下成分：氯化钠：4.5～13.5g/L，Hepes：10.0～20.0g/L；Tris：pH7～7.5，Proclin300：0.05～0.15ml/L。所述氯化钙试剂选择常规凝血检测中使用的25mmol/L氯化钙试剂，所述氯化钙试剂含有以下成分：氯化钙：1.7～3.9g/L，Proclin300：0.05～0.15ml/L。优选地，所述反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂的体积比为10:15:50:35。以上试剂或溶液的溶剂均为电导率≤1μs/cm(25℃)的纯化水。本专利技术的检测原理：在待测血浆中加入含有兔脑组织因子(TF)和兔脑磷脂的反应试剂，激活凝血系统，氯化钙试剂中的Ca2+作为促发剂，激活凝血反应，最终使凝血酶原活化形成凝血酶，生成的凝血酶作用于荧光试剂(Glu-Gly-Arg-AMC)，使之裂解并释放荧光基团(AMC)，荧光基团(AMC)在360nm波长的激发光激发下，发射出460nm的荧光，荧光强度与凝血酶生成呈相关性。通过监测荧光强度来实时监测凝血酶的生成，反映出凝血酶生成的时间和生成量，进而对出凝血状况进行评价。本专利技术中兔脑磷脂是代替能提供磷脂的血小板因子，为凝血反应提供丰富的催化表面；兔脑组织因子及FⅢ，是唯一不存在健康人血浆中的凝血因子，广泛存在各种组织中，尤其是脑、胎盘和肺组织中含量尤为丰富，在血管内皮受损时释放于血液中，是血液凝固的始动因子；甘氨酸，能抑制pH值的改变，阻止凝血酶蛋白的变性；选用牛血清白蛋白，可有效阻止蛋白分子表面的吸附，使蛋白分子在水溶液中容易保持其稳定结构，不易变性失去活性，并且在冻干试剂中与甘氨酸形成冻干品的骨架物质；选用氯化钠能与蛋白质形成复杂的静电相互作用而稳定酶蛋白；proclin300作为一种生物防腐剂，即能有效抑制微生物的繁殖，又能避免因微生物的污染，同时还可以保持活性物质的活性；选用Hepes-Tris作为缓冲体系，能保持pH的稳定，且能保持活性物质的稳定；二甲基亚砜是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，能够使不易溶于纯化水的荧光底物(Glu-Gly-Arg-AMC)充分溶解后，再与纯化水进行充分混合。所述的动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，在具有持续发射360nm波长的激发光，并能每隔15S检测一次460nm发射光的荧光检测模块，分析软件可以计算被测样本中实时凝血酶的生成。在整个凝血过程中，结果以每个点的实时凝血酶生成(nM)来计算。样本中加入兔脑磷脂/兔脑组织因子混合物及氯化钙后开始凝固，在经过一段延迟期(tlag)后凝血酶生成量达到或超过阈值，开始计算凝血酶生成量，到凝血酶生成速率最大值即为(Peak)的时间(tPeak)，然后凝血酶的生成逐渐减少，直到凝血酶生成量低于检测阈值的全过程监测，凝血酶生成曲线的积分面积即表示凝血酶生成量，见附图2，其具体使用方法如下：(1)将待检测的血浆40ul加入到反应杯中；(2)将反应试剂:反应缓冲液:荧光试剂:氯化钙试剂使用时按10ul:15ul:50ul:35ul比加入到待测血浆中；(3)加入氯化钙试剂，37℃温育并进行荧光检测，将测试结果与凝血酶校准曲线对比，得到待测样品的凝血酶含量，并且记录从检测开始到检测结束时间作为凝血酶生成时间。本专利技术的有益效果：(1)凝血酶的测定能提供更多的信息：凝血酶生成的量，凝血酶活性状态的持续时间；(2)荧光信号受浊度的影响小，凝块的出现不会影响信号，血小板的存在也不会干扰测量，这使得研究血小板在大样本凝血中的作用成为可能；(3)动态的全过程凝血酶生成监测，能真实准确的反映整个凝血过程，可以更加准确对出凝血状况进行评估；(4)是最佳的止凝血全过程的描述者，是目前凝血功能实验的重要补充；(5)了解凝血机制和病人管理研究中具有潜在的应用。附图说明图1为凝血酶浓度与荧光强度的校准曲线。图2为本专利技术实时检测过程曲线及报告参数示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，其特征在于包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：3.5～5.5ml/L，兔脑组织因子：3.5～5.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，所述荧光试剂含有以下成分：Glu‑Gly‑Arg‑AMC：0.5～1.0mmoL/L，二甲基亚砜:0.5～1.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，甘氨酸：30～50g/L，Proclin 300：0.05～0.15ml/L。

【技术特征摘要】
1.一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，其特征在于包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：3.5～5.5ml/L，兔脑组织因子：3.5～5.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，所述荧光试剂含有以下成分：Glu-Gly-Arg-AMC：0.5～1.0mmoL/L，二甲基亚砜:0.5～1.5ml/L，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/L，甘氨酸：30～50g/L，Proclin300：0.05～0.15ml/L。2.如权利要求1所述动态监测体内凝血酶生成能力的试剂盒，其特征在于，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：4.5ml/L，兔脑组织因子：4.5ml/L，牛血清白蛋白：5.0g/L。3.如权利要求1所述动态监测体内凝血酶生成能力的试剂盒，其特征在于，所述荧光试剂含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘介，鲁翌，徐琳，
申请(专利权)人：武汉塞力斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42