GFRA1基因甲基化检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术发现了可以用于结直肠癌诊断的生物标志物，提供了一种可以用于结直肠癌检测的试剂盒，该试剂盒可以用于结直肠癌诊断的诊断中。本发明专利技术的GFRA1基因甲基化检测试剂盒,包含GFRA1基因甲基化特异性引物和GFRA1基因甲基化特异性荧光探针，GFRA1基因甲基化特异性引物为GFRA1_F和GFRA1_R，GFRA1_F序列如SEQ ID No.1:5’‑GAGTTGTCGTCGTCGTTATCG‑3’；GFRA1_R序列如SEQ ID No.2:5’‑ATTCAACCCGAAACGCTAAACG‑3’；GFRA1基因甲基化特异性荧光探针为GFRA1_P，GFRA1_P序列如SEQ ID No.3:5’‑TTCCGAACGTCGCGAACGAAAC‑3’。本发明专利技术地试剂盒的分析灵敏度为1024:1，试剂盒的可重复性为100％，试剂盒的灵敏性为100％，特异性为95％。

Gfra1 gene methylation detection kit and its application

【技术实现步骤摘要】
GFRA1基因甲基化检测试剂盒及其应用
本专利技术属于分子和细胞生物学领域，特别涉及基因甲基化检测。
技术介绍
GDNF家族受体α-1(GFRα1)，也被称为GDNF受体，是一种蛋白质，在人中由GFRA1基因编码，GFRA1被认为是原癌基因。而结肠直肠癌(carcinomaofcolonandrectum)胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。2015中国癌症统计数据显示我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。近年来,随着人民生活水平的不断提高,饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化,我国结直肠癌(colorectalcancer,CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中,结肠癌的发病率上升尤为显著。大多数患者发现时已属于中晚期。结肠直肠癌的早期筛查和诊断对结肠直肠癌的诊疗工作极为重要。目前一些基于基于粪便甲基化基因检测的方法，进行结直肠癌早期筛查，目前已取得成就，证明其可以有效发现结直肠癌及其癌前病变，成功地为结直肠癌的防治提供一项新的技术。但目前可以用于检测位点仍不够丰富，检测位点较为单一。
技术实现思路
为进一步为结直肠癌诊疗提供可用的检测试剂,提高医疗机构结直肠癌诊疗水平,改善结直肠癌患者预后。本专利技术发现了GFRA1基因甲基化与结直肠癌有关。我们测定了20例结直肠癌组织中GFRA1基因甲基化情况，结果20例结直肠癌组织中均存在GFRA1基因甲基化，结直肠癌组织中GFRA1基因甲基化比例为100％。因而认为GFRA1基因甲基化可以作为用于结直肠癌诊断的生物标志物。该试剂盒可以用于结直肠癌诊断的诊断中。根据本专利技术的一方面，提供了GFRA1基因甲基化检测试剂盒,GFRA1基因甲基化检测试剂盒包含GFRA1基因甲基化特异性引物和GFRA1基因甲基化特异性荧光探针，GFRA1基因甲基化特异性引物为GFRA1_F和GFRA1_R，GFRA1_F序列如SEQIDNo.1:5’-GAGTTGTCGTCGTCGTTATCG-3’；GFRA1_R序列如SEQIDNo.2:5’-ATTCAACCCGAAACGCTAAACG-3’；GFRA1基因甲基化特异性荧光探针为GFRA1_P，GFRA1_P序列如SEQIDNo.3:5’-TTCCGAACGTCGCGAACGAAAC-3’。根据本专利技术的一方面，提供了GFRA1基因甲基化检测试剂盒还包含内参基因GAPDH基因，GAPDH基因的GAPDH基因甲基化特异性引物如下：GAPDH_F序列如SEQIDNo.4：5’-TGGGGTGGTATAGTGGGGTGGTG-3’；GAPDH_R序列如SEQIDNo.5：5’-CTACCCAACACCCCCAATCATAC-3’；GAPDH基因甲基化特异性荧光探针如下：GAPDH_P序列如SEQIDNo.6：5’-ACACTACCACCCACAATCTAAACACA-3’。根据本专利技术的一方面，提供了GFRA1基因甲基化特异性荧光探针使用的荧光基团为FAM和BHQ1。根据本专利技术的一方面，提供了GFRA1基因甲基化检测试剂盒还包含阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品为经亚硫酸盐处理的甲基化人类基因组使用浓度为每微升的含量分别为：51.2ng，25.6ng，12.8ng，6.4ng，3.2ng，1.6ng，0.8ng，0.4ng，0.2ng，0.1ng，0.05ng，0.02ng，0.01ng，0.05ng，0.025ng，0.0125ng；阴性质控品为经亚硫酸盐处理的非甲基化人类基因组DNA使用浓度为每微升的含量分别为：51.2ng，25.6ng，12.8ng，6.4ng，3.2ng，1.6ng，0.8ng，0.4ng，0.2ng，0.1ng，0.05ng，0.025ng，0.0125ng。根据本专利技术的一方面，提供了一种用于GFRA1基因甲基化检测试剂盒的应用，GFRA1基因甲基化检测试剂盒用于结直肠癌甲基化检测检测。附图说明图1、为本专利技术实施例中3个靶基因和内参基因的扩增曲线；图2、为本专利技术实施例中是本专利技术涉及到的PCR扩增产物测序的结果；具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本专利技术的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本专利技术的其他实施例，都属于本专利技术的权利保护范围。下面将结合附图对本专利技术作进一步的说明。1、PCR检测引物，靶基因引物和荧光探针序列为2、PCR检测探针，内参基因引物和荧光探针序列为具体判定标准如下表：1)、阳性质控品内参基因PCR反应Ct值在36-42范围内且有明显指数扩增曲线，检测基因PCR反应Ct值在36-42范围内且有明显指数扩增曲线；阴性质控品内参基因PCR反应Ct值在36-42范围内且有明显指数扩增曲线，检测基因PCR反应无扩增曲线升起或Ct值大于45，实验有效。2)、检测样品的内参PCR反应Ct值在36-42范围内且有明显指数扩增曲线，表明样品质量合格；若同时检测基因PCR反应Ct值在36-42范围内且有明显指数扩增曲线，则判断为阳性；若检测基因PCR反应无扩增曲线升起或Ct值大于45，则判断为阴性。3)、若阳性质控品和/或阴性质控品内参基因PCR反应无扩增曲线升起或Ct值大于45；或者若阳性质控品检测基因PCR反应无扩增曲线升起或Ct值大于45，表明此次实验结果无效，建议更换试剂盒重新试验。4)、若检测样品内参基因PCR反应无扩增曲线升起或Ct值大于45，表明样品质量不合乎要求，应重新收集样本提取DNA，并重新进行PCR检测。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1DNA甲基化检测引物和荧光探针的设计，如下表：GFRA1、VAV3、ELMO1为靶基因，GAPDH为内参基因。如图1为3个靶基因和内参基因的扩增曲线；如图2为涉及到的PCR扩增产物测序的结果；实施例2DNA甲基化检测试剂盒分析灵敏度、特异度和最低检测限测试1、材料与试剂(1)靶基因的引物、荧光探针，内参基因的引物、荧光探针。如下表：GFRA1、VAV3、ELMO1为靶基因，GAPDH为内参基因。(2)进行荧光定量PCR所需的一般试剂:2xPCR反应液，无核酸酶纯净水，2xPCR反应液含有PCR反应缓冲液、Mg2+、和dNTPs。(3)阳性质控品。阳性质控品为经亚硫酸盐处理的甲基化人类基因组DNA。按照定量结果稀释阳性质控品，使其每微升的含量分别为：51.2ng，25.6ng，12.8ng，6.4ng，3.2ng，1.6ng，0.8ng，0.4ng，0.2ng，0.1ng，0.05ng，0.02ng，0.01ng，0.05ng，0.025ng，0.0125n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.GFRA1基因甲基化检测试剂盒,其特征在于，所述GFRA1基因甲基化检测试剂盒包含GFRA1基因甲基化特异性引物和GFRA1基因甲基化特异性荧光探针，所述GFRA1基因甲基化特异性引物为GFRA1_F和GFRA1_R，所述GFRA1_F序列如SEQIDNo.1:5’‑GAGTTGTCGTCGTCGTTATCG‑3’；所述GFRA1_R序列如SEQIDNo.2:5’‑ATTCAACCCGAAACGCTAAACG‑3’；所述GFRA1基因甲基化特异性荧光探针为GFRA1_P，所述GFRA1_P序列如SEQIDNo.3:5’‑TTCCGAACGTCGCGAACGAAAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.GFRA1基因甲基化检测试剂盒,其特征在于，所述GFRA1基因甲基化检测试剂盒包含GFRA1基因甲基化特异性引物和GFRA1基因甲基化特异性荧光探针，所述GFRA1基因甲基化特异性引物为GFRA1_F和GFRA1_R，所述GFRA1_F序列如SEQIDNo.1:5’-GAGTTGTCGTCGTCGTTATCG-3’；所述GFRA1_R序列如SEQIDNo.2:5’-ATTCAACCCGAAACGCTAAACG-3’；所述GFRA1基因甲基化特异性荧光探针为GFRA1_P，所述GFRA1_P序列如SEQIDNo.3:5’-TTCCGAACGTCGCGAACGAAAC-3’。2.根据权利要求1所述的GFRA1基因甲基化检测试剂盒,其特征在于，所述GFRA1基因甲基化检测试剂盒还包含内参基因GAPDH基因，所述的GAPDH基因的GAPDH基因甲基化特异性引物如下：GAPDH_F序列如SEQIDNo.4：5’-TGGGGTGGTATAGTGGGGTGGTG-3’；GAPDH_R序列如SEQIDNo.5：5’-CTACCCAACACCCCCAATCATAC-3’；GAPDH基因甲基化特异性荧光探针如下：GAPDH_P序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙喜元，
申请(专利权)人：江苏元丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32