一种抗天门冬氨酸蛋白酶A（NAPSIN A）单克隆抗体及其免疫检测应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种由杂交瘤细胞株OTI8A5(保藏编号为CGMCC No.18190)分泌的抗天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)单克隆抗体。本发明专利技术还涉及OTI8A5分泌的单克隆抗体在制备用于检测NAPSIN A蛋白的免疫检测工具中的应用，包含免疫组织化学检测试剂盒与标记肿瘤试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与NAPSIN A蛋白特异性结合，显著提高了NAPSIN A蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

A monoclonal antibody against aspartase a (Napsin a) and its immunoassay application

【技术实现步骤摘要】
一种抗天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSINA)单克隆抗体及其免疫检测应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的单克隆抗体与天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSINA)特异性结合用于免疫检测的方法和应用。
技术介绍
NAPSINA是一种天门冬氨酸蛋白酶，其主要参与蛋白水解过程，诱导蛋白前体成熟，维持组织形态及正常功能。NAPSINA蛋白由420个氨基酸组成，是由19q13.33号染色体上NAPSINA基因编码的，包含24个氨基酸的信号肽，36个氨基酸的前肽区，342个氨基酸的成熟区和18个氨基酸的C末端残基，相对分子量为45KDa左右。NAPSINA蛋白是由2条肽链组成的同质二聚体，在人肺和肾脏组织中显著表达。在肺中，NAPSINA蛋白主要表达于II型肺泡上皮细胞，在肺泡巨噬细胞、I型肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮及一部分淋巴细胞中也有少量的表达。在肾中，NAPSINA蛋白主要在肾皮质的近端小管曲部、近端小管直部、远端小管曲部的上皮细胞中显著表达，少数肾髓质的集合管及髓袢细段的上皮细胞内有轻微表达。肿瘤学研究显示，NAPSINA蛋白主要表达于肺腺癌和肾细胞癌。非小细胞肺癌患者占所有肺癌患者的80％，主要分为肺腺癌和肺鳞癌。NAPSINA蛋白在90％的肺腺癌组织中呈阳性表达，在肺鳞癌组织中呈现阴性表达，是用于鉴别诊断区分肺腺癌和肺鳞癌的标志物之一。总而言之，NAPSINA蛋白不仅为肿瘤检测提供一个指标，对肿瘤的发生和进展都起着重要作用。目前临床上主要通过免疫组织化学(简称免疫组化，Immunohistochemistry，IHC)病理实验检测肿瘤组织中NAPSINA蛋白的表达状况，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对NAPSINA蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种与NAPSINA蛋白特异性结合的单克隆抗体，及其在制备用于检测NAPSINA蛋白的免疫检测工具中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种能分泌抗NAPSINA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株OTI8A5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2019年7月11日，保藏编号为CGMCCNo.18190。本专利技术还提供了一种特异性结合NAPSINA的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株OTI8A5分泌。本专利技术所述单克隆抗体制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：基因合成NAPSINA核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，ORF长度为543bp，相对应的NAPSINA蛋白包括第62-244氨基酸序列，如SEQIDNo.2所示，氨基酸长度为181aa。将合成的NAPSINA的ORF插入表达载体pET23a-His(购于Origene公司)，构建NAPSINA的重组表达质粒pET23a-His-rNAPSINA。(2)重组NAPSINA蛋白的表达与纯化：将构建的NAPSINA重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的重组NAPSINA蛋白。(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组NAPSINA蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗NAPSINA蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗NAPSINA蛋白单克隆抗体。通过免疫检测方法，如蛋白印记(Western-blot，WB)、免疫组织化学实验(IHC)，验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。经过上述方法制备后，筛选出能够分泌抗NAPSINA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为OTI8A5，亚型鉴定为IgG1，并于2019年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.18190。本专利技术还提供了由杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的单克隆抗体在制备用于检测NAPSINA蛋白的免疫检测工具中的应用。作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本专利技术还提供一种免疫组织化学检测试剂盒，包括由杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的抗NAPSINA蛋白单克隆抗体，可检测组织细胞中NAPSINA蛋白的表达状况。此外，本专利技术还提供了杂交瘤细胞株OTI8A5分泌产生的抗NAPSINA蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。作为优选，所述肿瘤细胞包括肺腺癌细胞系(NCIH2347)；肿瘤组织包括肺腺癌，肺鳞癌和前列腺癌组织。本专利技术提供了由杂交瘤细胞株OTI8A5可稳定分泌的单克隆抗体，且与NAPSINA蛋白特异性结合，显著提高了NAPSINA蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各类肿瘤中NAPSINA蛋白的标记。生物保藏信息说明用于保藏分泌抗NAPSINA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株OTI8A5的分类命名为：鼠抗人天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSINA)单克隆杂交瘤细胞株保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位简称：CGMCC保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所保藏日期：2019年7月11日保藏编号：CGMCCNo.18190附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1所示为实施例1中NAPSINA的ORF克隆位点设计图。图2所示为实施例2中WB检测重组NAPSINA蛋白的结果图，以anti-His抗体检测重组NAPSINA蛋白在E.coli细胞裂解液中的表达。其中泳道L为转染空载体质粒的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果；泳道R为转染pET23a-His-rNAPSINA质粒的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果。图3所示为实施例2中SDS-PAGE电泳检测重组NAPSINA蛋白的结果图，用镍亲和层析柱纯化重组NAPSINA蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色。图4所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测NCIH2347肺腺癌细胞系中NAPSINA表达的灵敏性对比图，箭头指示为NAPSINA蛋白阳性表达的细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSINA单克隆抗体，2μg/ml；IP64抗体，9μg/ml)。图5所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测肺腺癌组织中NAPSINA表达灵敏性对比图，箭头指示为NAPSINA蛋白阳性表达的肺腺癌细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSINA单克隆抗体，2μg/ml；IP64抗体，9μg/ml)。图6所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测肺鳞癌组织中NAPSINA表达灵敏性对比图，箭头指示为NAPSINA蛋白阴性表达的肺鳞癌细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSINA单克隆抗体，2μg/ml；IP64抗体，9μg/ml)。图7所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，其特征在于：特异性结合天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)，这种抗体是由保藏编号为CGMCC No.18190的杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于：特异性结合天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSINA)，这种抗体是由保藏编号为CGMCCNo.18190的杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的。2.一种杂交瘤细胞株OTI8A5，其特征在于：分泌与NAPSINA蛋白特异性结合的单克隆抗体，这种杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCCNo.18190。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测NAPS...

【专利技术属性】
技术研发人员：张乾坤，叶露，任琪，张冉冉，王成林，钮倩，付伟，何为无，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32