蓖麻毒素B的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蓖麻毒素B的制备及其应用，涉及抗糖尿病药物的技术领域，具体为一种用于治疗2型糖尿病的重组蛋白药物，其能降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，可以开发成治疗2型糖尿病的药物｡

Preparation and application of ricin B

【技术实现步骤摘要】
蓖麻毒素B的制备及其应用
本专利技术涉及抗糖尿病蛋白药物
，具体为一种用于对2型糖尿病的重组蓖麻毒素B链蛋白突变体。
技术介绍
糖尿病是一种因胰岛素分泌不足和或胰岛素抵抗而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的免疫系统疾病，涉及全身各个系统，甚至可诱发许多致命性并发症，严重危害人类健康，糖尿病已经成为当前危害人类健康的第三大疾病。90％以上的糖尿病患者为2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)。目前，全世界约有2.46亿人患有T2DM，预计在20年内T2DM患者数目将增至3.8亿。中国是全球糖尿病患者人数最多的国家，但中国T2DM患者的血糖达标率严重不足。现阶段治疗T2DM的药物主要为传统抗糖尿病药物，包括：磺酰脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂及胰岛素等，但这些药物均存在不同程度的不良反应，如引发低血糖、胃肠道不适、肥胖等。因而开发更优良的糖尿病治疗新药显得尤为必要，随着对糖尿病基础理论研究的不断深入，抗糖尿病新药的开发成为国内外研究的热点。许多制药公司正在开发新的抗糖尿病药物，以满足目前的糖尿病治疗需求。由于糖尿病复杂的发病机制，使得医学工作者在药物研发的过程中，逐渐发现了许多潜在的抗糖尿病疗法的新型目标。与此同时，据统计，2013至今进入Ⅲ期临床试验或递交NDA/BLA或获得批准用于治疗糖尿病的药物有65种，分为非胰岛素类抗糖尿病药(41种，包括用于治疗糖尿病相关疾病的药物10种，占63.1％)、胰岛素类药(8种，12.3％)和复方制剂(16种，24.6％)。这些数据表明，国际制药公司将开发糖尿病新药的重点集中在非胰岛素类抗糖尿病药物上，本专利技术重组蓖麻毒素B链蛋白在一定程度上契合国际药物开发的需求，应用前景广阔。蓖麻毒素(Ricin)是一种由A链(RTA)和B链(RTB)两条链通过二硫键连接的异源二聚体糖蛋白。其中，RTA是一种在哺乳动物细胞内可抑制蛋白质合成的核糖体灭活蛋白。RTB是一个两叶形结构的分子，由两个相同折叠的拓扑学球状结构域构成，每一个区域又包括三个亚区(ɑ，β，γ)，只有1ɑ和2β有明显的半乳糖结合活性，无毒，具有凝集素活性，可协助A链进入细胞内发挥生物学功能。RTB可以结合不同的糖结构，调节各种生物过程，包括细胞与宿主、病原体相互作用和先天免疫反应。目前，通过国内外公开出版物的检索并未发现重组蓖麻毒素B链蛋白突变体治疗2型糖尿病以及并发症的相关报道。
技术实现思路
为了解决目前治疗2型糖尿病药物效果不理想，副作用较多的问题，本专利技术提供一种重组蓖麻毒素B链蛋白突变体及其表达方法，并验证其对2型糖尿病大鼠的降糖效果。本专利技术的技术方案为：包含SEQID：1序列的蛋白在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。包含SEQID：1序列的蛋白的插入、删除、替换等突变体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。所述SEQID：1蛋白序列的编码核苷酸为SEQID：2。SEQID：1序列的蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠空腹血糖水平。SEQID：1序列的蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠糖化血红蛋白水平。SEQID：1序列的蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠的饮水量。SEQID：1序列的蛋白可增加2型糖尿病模型的大鼠的体重，改善消瘦症状。SEQID：1序列的蛋白可改善2型糖尿病模型的大鼠的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)水平。SEQID：1序列的蛋白可改善2型糖尿病模型的大鼠的耐糖能力。SEQID：1序列的蛋白的制备方法，通过大肠杆菌表达系统制备。所述大肠杆菌表达系统所用载体为PET系列载体，所用表达菌种为BL21。本专利技术提供了一种重组蓖麻毒素B链蛋白突变体的表达方法，通过大肠杆菌表达系统表达重组蓖麻毒素B链蛋白突变体。本专利技术还提供了重组蓖麻毒素B链蛋白突变体抗2型糖尿病大鼠的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术的重组蓖麻毒素B链蛋白突变体具有改善2型糖尿病大鼠的体重和饮水量，同时还具有显著的降低血糖和血脂的效果，糖耐量实验证明该蛋白对2型糖尿病大鼠有治疗作用。具体实施方式本专利技术提供了重组蓖麻毒素B链蛋白突变体抗2型糖尿病的应用，通过重组蓖麻毒素B链蛋白突变体对2型糖尿病大鼠的实验证明：本专利技术的重组蓖麻毒素B链蛋白突变体可以改善2型糖尿病。实施例1重组蓖麻毒素B链蛋白突变体制备1大肠杆菌表达工程菌BL21(DE3)/PET28a-tRTB的获得在氨基酸序列不变的条件下，根据已有的蓖麻毒素B链(rRTB)突变体进行密码子优化，根据上述的蓖麻毒素B链密码子优化后的全序列作为模板，用tRTBsenseprimer和tRTBanti-senseprimer进行PCR扩增，获得的PCR产物连接至pMD19-Tsimple克隆载体(宝生物工程(大连)有限公司)，获得pMD19T-tRTB。与经过同样NdeI与HindIII限制性酶切的PET-28a表达载体链接，得到的链接产物转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选获得阳性菌，对阳性菌提取质粒后进行测序，结果该质粒为序列表中序列1插入PET28a表达载体的NdeI与HindIII的酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为PET28a-tRTB，其对应的阳性菌命名为BL21(DE3)/PET28a-tRTB。2重组蓖麻毒素B链蛋白突变体的诱导表达与纯化将上述获得的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-tRTB按1：100v/v的比例接种于5mL含Kan+(浓度为50μg/mL)的TB培养基中，在37℃下，180r/min恒温振荡培养至OD600＝0.6时，诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，同上述培养条件即在37℃下，180r/min恒温振荡诱导10h；经诱导10h后，在4℃下，8000r/min离心获得菌体沉淀。获得的菌体沉淀重悬用超声破碎方法将其裂解，离心获得包涵体沉淀；经12％SDS-PAGE电泳分析，重组蓖麻毒素B链蛋白在包涵体有特异性的表达，且其蛋白分子量为38Kda，与预期的蛋白大小相符合。将上述获得的包涵体溶解液进行亲和层析，当咪唑浓度为300mmol/L时，收集洗脱峰即为纯化后的重组蓖麻毒素B链蛋白。纯化后的重组蓖麻毒素B链蛋白进行透析梯度复性。复性结束后用PEG20000浓缩蛋白，BCA法测定蛋白浓度，用0.22μm滤器过滤除菌后保存于-80℃。实例2重组蓖麻毒素B链蛋白突变体抗2型糖尿病大鼠效果实验1实验动物和分组1.1模型的制作试验用的雄性wistar大鼠，随机留取10只作为正常对照组，其他大鼠高脂饲料喂养4W后，其余单次小剂量(30mg/kg)腹腔注射STZ诱导2型糖尿病模型(STZ溶解在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在半小时内注射完)，1W后，禁食但不禁水12h，尾静脉取血，应用血糖仪测定空腹血糖值(FBG)，其中FBG≥7.8mmol/l者为2型糖尿病模型成功。试验动物在动物中心12小时明暗交替的标准化饲养间喂养，室温在20-25℃，室内相对的湿度45％-60％，饲养间内通风良好，试验期间给予标准颗粒的正常饲料和高脂高糖饲料，试验动物自由饮水。1.2试验动物分组及给药成功造模的大鼠选取50只，随机分为5组，分别是：2型糖尿病模型组、阳性药物对照组、蛋白高浓度组、蛋白中浓度组及蛋白低浓度组。阳性对照组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含SEQ ID：1序列的蛋白在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.包含SEQID：1序列的蛋白在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的的蛋白，其特征在于：该蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠空腹血糖水平。3.根据权利要求1所述的的蛋白，其特征在于：该蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠糖化血红蛋白水平。4.根据权利要求1所述的的蛋白，其特征在于：该蛋白可降低2型糖尿病模型的大鼠的饮水量。5.根据权利要求1所述的的蛋白，其特征在于：该蛋白可增加2型糖尿病模型的大鼠的体重，改善消瘦症状。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文森，许娜，侯峰，曹利利，宫鹏涛，李思明，陈星远，丁鹤，王典，
申请(专利权)人：侯峰，
类型：发明
国别省市：天津,12